Inmunofluerescencia Indirecta
Páginas: 5 (1203 palabras)
Publicado: 1 de febrero de 2013
IDENTIFICACION DE VIRUS RESPIRATORIOS USANDO ANTICUERPOS MONOCLONALES POR INMUFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
I. INTRODUCCION
La clave de la inmunofluorescencia es la utilización de anticuerpos de especies no humanas conjugados con un fluorocromo y específicos contra inmunoglobulinas o complemento humano. Describimos a continuación las técnicas de marcaje directoe indirecto.
En la técnica directa, la más utilizada de forma rutinaria, se utiliza un anticuerpo primario antiinmunoglobulina humana (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM) o anticomplemento humano (anti-C3) de origen animal y conjugado generalmente con FITC.
El marcaje indirecto utiliza dos anticuerpos: primario y secundario. En el estudio de enfermedades ampollosas elanticuerpo primario es una IgG antiinmunoglobulina humana o anticomplemento humano generado en una especie no humana (ratón, cabra, conejo y otros). El anticuerpo secundario en una anti-IgG murina, anti-IgG caprina o lo que corresponda según el animal de origen, que sólo se une donde se haya unido previamente el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario es el que está conjugado con el fluorocromo ysu localización puede verse mediante iluminación con la longitud de onda específica el que estimula este fluorocromo. La técnica de marcaje indirecto aumenta la sensibilidad, pero reduce la especificidad al incrementar la tinción inespecífica.
El empleo de la reaccón de inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ha permitido ampliar el
estudio serológico en diferentesenfermedades infecciosas. Dicha técnica, de ejecución relativamente simple y rápida, ofrece la doble ventaja de ser aplicable tanto en la pesquisa de diferentes agentes infecciosos, lo que depende del microorganismo que se emplee como antigeno, como en la demostracion de diferentes tipos de anticuerpos, de acuerdo con la antigammaglobulina que se utilice como reactivo.
La IFI para VirusResiratorios es una técnica de tinción indirecta de anticuerpo fluorescente para la identificación de virus en cultivos de tejido infectado y en muestras preparadas de de hisopados nasal y faríngeo combinado. Consta de dos reactivos inmunológicos, un anticuerpo monoclonal antiviral de ratón sin conjugar que se aplica a células fijas y se une al antígeno viral en cuestión, si está presente en elsustrato celular; luego se añade una inmunoglobulina anti-ratón conjugada con fluoresceína isotiocianato (FITC) y se observa en microscopio de inmunofluorescencia a 570 nm. El uso de anticuerpos monoclonales maximiza la especificidad. Una reacción positiva es aquella en la cual se observa una fluoresceína brilante de color verde manzana y la células no infectadas se contratiñen con azul de Evan.[pic]
Fig. 1 Técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección
de anticuerpos.
II. DESARROLLO DE LA PRACTICA
• Agitar el hisopo en el medio de transporte utilizando un vortex.
• Antes de retirar el hisopo presionarlo contra las paredes del tubo para escurrir el líquido.
• Centrifugar a 1700 rpmpor 10 minutos. Separar el sobrenadante y conservarlo en un vial estéril de 2ml a 4°C para aislamiento viral en cultivo de células o almacenar a – 70°C.
• Agregar al sedimento de células 2.0 ml de PBS pH7.2, resuspender el sedimento celular y luego agregar 2.0 ml mas de PBS.
• Homogenizar en un vortex y Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos.
• Descartar elsobrenadante, eliminar el moco y resuspender el sedimento de células en PBS pH7.2
• Homogenizar en un vortex y Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos.
• Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento con el PBS sobrante, partir de la suspensión obtenida proceder a cubrir cuatro pocillos de la lámina portaobjetos, una lámina por paciente.
• Se debe comprobar por...
I. INTRODUCCION
La clave de la inmunofluorescencia es la utilización de anticuerpos de especies no humanas conjugados con un fluorocromo y específicos contra inmunoglobulinas o complemento humano. Describimos a continuación las técnicas de marcaje directoe indirecto.
En la técnica directa, la más utilizada de forma rutinaria, se utiliza un anticuerpo primario antiinmunoglobulina humana (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM) o anticomplemento humano (anti-C3) de origen animal y conjugado generalmente con FITC.
El marcaje indirecto utiliza dos anticuerpos: primario y secundario. En el estudio de enfermedades ampollosas elanticuerpo primario es una IgG antiinmunoglobulina humana o anticomplemento humano generado en una especie no humana (ratón, cabra, conejo y otros). El anticuerpo secundario en una anti-IgG murina, anti-IgG caprina o lo que corresponda según el animal de origen, que sólo se une donde se haya unido previamente el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario es el que está conjugado con el fluorocromo ysu localización puede verse mediante iluminación con la longitud de onda específica el que estimula este fluorocromo. La técnica de marcaje indirecto aumenta la sensibilidad, pero reduce la especificidad al incrementar la tinción inespecífica.
El empleo de la reaccón de inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ha permitido ampliar el
estudio serológico en diferentesenfermedades infecciosas. Dicha técnica, de ejecución relativamente simple y rápida, ofrece la doble ventaja de ser aplicable tanto en la pesquisa de diferentes agentes infecciosos, lo que depende del microorganismo que se emplee como antigeno, como en la demostracion de diferentes tipos de anticuerpos, de acuerdo con la antigammaglobulina que se utilice como reactivo.
La IFI para VirusResiratorios es una técnica de tinción indirecta de anticuerpo fluorescente para la identificación de virus en cultivos de tejido infectado y en muestras preparadas de de hisopados nasal y faríngeo combinado. Consta de dos reactivos inmunológicos, un anticuerpo monoclonal antiviral de ratón sin conjugar que se aplica a células fijas y se une al antígeno viral en cuestión, si está presente en elsustrato celular; luego se añade una inmunoglobulina anti-ratón conjugada con fluoresceína isotiocianato (FITC) y se observa en microscopio de inmunofluorescencia a 570 nm. El uso de anticuerpos monoclonales maximiza la especificidad. Una reacción positiva es aquella en la cual se observa una fluoresceína brilante de color verde manzana y la células no infectadas se contratiñen con azul de Evan.[pic]
Fig. 1 Técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección
de anticuerpos.
II. DESARROLLO DE LA PRACTICA
• Agitar el hisopo en el medio de transporte utilizando un vortex.
• Antes de retirar el hisopo presionarlo contra las paredes del tubo para escurrir el líquido.
• Centrifugar a 1700 rpmpor 10 minutos. Separar el sobrenadante y conservarlo en un vial estéril de 2ml a 4°C para aislamiento viral en cultivo de células o almacenar a – 70°C.
• Agregar al sedimento de células 2.0 ml de PBS pH7.2, resuspender el sedimento celular y luego agregar 2.0 ml mas de PBS.
• Homogenizar en un vortex y Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos.
• Descartar elsobrenadante, eliminar el moco y resuspender el sedimento de células en PBS pH7.2
• Homogenizar en un vortex y Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos.
• Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento con el PBS sobrante, partir de la suspensión obtenida proceder a cubrir cuatro pocillos de la lámina portaobjetos, una lámina por paciente.
• Se debe comprobar por...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.