Inmunofluorescencia

INMUNOFLUORESCENCIA

Es una técnica histoquímica o citoquímica que permite la localización e identificación de antígenos y anticuerpos . Consiste en conjugar colorantes fluorescentes conanticuerpos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando lareacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.

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Conjugados  Contenido total de proteina en mg/mL Unidades precipitantes/mL relación fluorocromo/proteina (F/P)  Titulo final  Debe conservarse en congelación, alicuotado.  Debe estandarizarse para asegurar su buena calidad.

Un buen conjugadodebe tener:  Fluorescencia intensa  Reacción específica con los antígenos

Depende de:
Calidad y concentración de los Acs en el suero  Propiedades de la sustancia fluorescente  Modificaciones queambos pueden sufrir en el acople  Intensidad de marcación  Homogeneidad de marcación  Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas
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Anticuerpos Para mayor especificidad utilizarantígenos puros para inmunizar Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales Purificar la fracción de Ig a marcar Verificar título de anticuerpos Existe un estrecho paralelismoentre título precipitante y fluorescente Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.

Antígenos  Conocido (sustrato) en pruebas indirectas: debe ser puro y de calidad óptima. Desconocido en pruebas directas. Liquido de montaje Glicerol 9 partes más 1 parte de buffer pH 7,2.Proporciona viscosidad , reduce el indice de refracción y aumenta la eficiencia cuántica del sistema.Solución salina Se utiliza para los lavados y debe tener un pH 7,2.

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Portaobjetos  Deben tener un máximo de 1 mm de espesor.  Deben evitar al máximo la fluorescencia inespecífica....