Inmunohistoquímica

Introducción
La técnica empleada en esta práctica es la inmuncitoquímica, esta técnica nos permite realizar la localización y visualización de moléculas en cortes de tejidos. Esta visualización ocurre gracias al empleo de anticuerpos (Proteínas de tipo Inmunoglobulina G por su mayor poder de penetración en los tejidos).
Se basa en la alta especificidad y afinidad que presentan dichosanticuerpos para reconocer a las moléculas de interés y unirse a ellas. Además, tiene la ventaja que mediante la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o sustancias fluorescentes nos permite detectar cantidades mínimas de moléculas presentes en el tejido.
Las inmunoglobulinas G que son empleadas en esta técnica son producidas por unas células del sistema inmune (linfocitos B), y suelevada producción se consigue mediante la inyección en un animal de la molécula de interés, que reconocerá como extraña. Estos anticuerpos obtenidos tras el proceso de reacción pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir de él se purifican los anticuerpos producidos.
Las moléculas complejas como las proteínas presentan en su estructura diversos determinantes antigénicos,que son lugares capaces de desencadenar una respuesta inmune en el animal. Cada determinante antigénico activará un clon (grupo de linfocitos B) productores de los anticuerpos frente a dicha proteína. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B que han sido activados por la molécula inyectada irán a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica sedice que se están empleando “anticuerpos policlonales”.
Es importante tener en cuenta que las inmunoglobulinas tipo G presentan 2 dominios:
Fracción cristalizable
Dominio variable
El dominio variable es el que reconoce al determinante antigénico de nuestra molécula. Hay 2 sitios de unión, por lo que cada inmunoglobulina podría reconocer a 2 moléculas o determinantes antigénicos que han de seriguales y estar próximos entre sí.
La fracción cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglobulinas G producidas por los individuos de una misma especie.
Hay que tener especial cuidado en el proceso de fijación del tejido, ya que debe preservar al máximo a la molécula que queremos detectar, ya que si por cualquier razón se altera la estructura molecular, no será reconocidopor el anticuerpo.
Las inmunoglobulinas, aunque se hayan unido a la molécula que queremos detectar, no son visibles al microscopio, por eso tendremos que conjugar, es decir, unirla a otras moléculas que nos den una señal visible, para ello es necesario anticuerpos secundarios que se une a la región Fc (cristalizable) del anticuerpo primario. La Fc es característica de especies, por lo que, esnecesario utilizar anticuerpos obtenidos mediante la inmunización de un animal de experimentación de otra especie que la utilizada para obtener el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario tiene que estar conjugado a algún tipo de molécula que permite la visualización de la unión entre el antígeno- anticuerpo primario y anticuerpo secundario. Las moléculas que se utilizan para poner de manifiestola visualización del Anticuerpo suelen ser de dos tipos:
Fluorescencia: Se observan al microscopio de fluorescencia.
Enzimas: Convertir determinados sustratos solubles en productos insolubles y coloreados, que es donde se ha unido la inmunoglobulina. Ejemplo: Peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.
Si la conjugación ser realiza directamente con un marcador sobre la inmunoglobulina se denominamétodo de detección indirecta. La que más se suele emplear es la de detección indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la molécula marcadora.
Principalmente se usó método indirecto denominado Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP), pero el que hemos empleado en esta práctica es el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa.
La gran ventaja que...