Inmunologia Tlr

Expresión y Función de los receptores Toll en Eosinofilos: Activación por el ligando del receptor toll 7

Introducción
En la inflamación asociada a enfermedades alérgicas se puede observar una acumulación masiva de Eosinofilos la cual está relacionada a la patogénesis de dichas enfermedades, esto se debe a que los eosinofilos son capaces de liberar mediadores del tejido dañado
A pesar de quelos Ag son los principales mediadores de la respuesta inmune, muchos estudios han indicado que las infecciones por virus o bacterias también son responsables en la modulación de la inflamación alérgica. La activación directa de los eosinofilos por las moléculas derivadas de microbios representa una explicación de la relación entre la infección y la exacerbación de las alergias.
La expresión deTLR4 en los eosinofilos ha sido reportada por varios estudios pero la expresión y función de los otros receptores toll ha permanecido incierta; En el presente trabajo de investigación se ha estudiado la expresión y función de estos receptores y se ha demostrado que el ligando del receptor toll 7(R-848) es capaz de activar dichas células.
Materiales y Métodos
Reactivos
En dicho estudio seutilizo LPS, IFN-, PMA, citocromo c, entre otro, además R-848 fue sintetizado en laboratorios biológicos y farmacéuticos, y concentraciones de DMSO fueron utilizada como control en el marco de cada experimentación.
Preparación de la Célula y condiciones de cultivo
Eosinofilos obtenidos de voluntarios sanos fueron separados mediante centrifugación. Por otro lado neutrofilos y eosinofilos fueronpurificados mediante la misma técnica de centrifugación, los niveles de purificación fueron >99% y >98.6 respectivamente.
Dichas células fueron cultivadas en medios que contenían suplemento con 10% de FCS y antibióticos (Penicilina y Estreptomicina) a 37°C en 5% de CO2.
Citometria de flujo
Para investigar la expresión de los TLR, las células fueron incubadas con anti TLR1-mAb,anti-TLR2-mAb ó con anti-TLR4-mAb, luego fueron coloreadas con FICT contra IgG de ratón.
Las células teñidas fueron analizadas y al menos 3000 células fueron estimadas para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia.
Generación de Superoxido
La producción de superoxido por los eosinofilos fue medida por la inevitable reducción de citocromo c mediada por el superoxido dismutasa, para estolas células purificadas fueron resuspendidas en HBSS, esta solución fue medida posteriormente mediante la técnica de ELISA; la generación de superoxido fue medida con un coeficiente 21.1x 103 mol.cm y fue expresada como nanomoles de citocromo c reducidos por 1 x 106 células.
Análisis del Western Blot
A los eosinofilos purificados se les indujo lisis mediante el buffer de lisis congelado quecontiene 1% de P-40, 25 Mm de HCL, 150 mM de cloruro de Sodio, etc. Luego fueron transferidos eléctricamente a membranas de Hybond ECL, posteriormente las membranas fueron incubadas con HRP conjugado con IgG anti conejo por 30 minutos, las bandas reactivas se observaron con el sistema ECL.
Resultados
Expresión en los eosinofilos de TLR mRNA
Estudios anteriores habían confirmado la presencia deTLR2 y TLR4 en los eosinofilos pero la expresión de otros TLR mRNA no habían sido investigados hasta la fecha, mediante la técnica de PCR se cuantificaron los niveles de expresión de los TLR 1-10 en los eosinofilos en comparación con los neutrofilos; La fig. 1 muestra la expresión en los eosinofilos de TLR1, 7, 9, 10 y TLR6 en mínima cantidad, en adición a TLR4.
Estudios también habían confirmadola presencia de TLR1, 2 y 4 en los neutrofilos, la fig.1 demuestra que en estas células también se expresa TLR5, 6, 8, 9 y 10, al igual que mínimas cantidades de TLR7 (este receptor toll se expresa en mayor cantidad en los eosinofilos).
Activación de los eosinofilos por PAMP
Para estudiar las propiedades funcionales de los TLR en los eosinofilos se investigo el efecto de PAMP´S en muchas de las...