INTRODUCCI N

 INTRODUCCIÓN
En esta práctica vamos a ver la acción de la invertasa y calcularemos entre otras cosas la velocidad de la reacción que cataliza. La actividad enzimática se pone de manifiesto incubando el sustrato juntamente con la enzima y posteriormente paramos la reacción y medimos coloriméticamente la reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico que es lo que nos va a determinar la velocidad dela reacción. Se basa en que la sacarosa no contiene átomo de carbono anomérico libre y por lo tanto no es un azúcar reductor.
La enzima invertasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa a glucosa y fructosa, frecuentemente a esta reacción se denomina “inversión”. La invertasa se puede conseguir de células de levadura que se rompen por auto lisis, centrifugando y tomando el sobrenadante.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales: levadura de panadería, espectrofotómetro, baño termostatizado y centrífuga de mesa.
Reactivos:
- Bicarbonato sódico 0,1M
Tampón acetato sódico 0,025M, pH:4,5
Ácido 3,5-dinitrosalicílico
Reactivo Biuret
Disolución patrón de albúmina sérica bovina
Disolución de glucosa 0,0025M- fructosa 0,0025M (azúcar invertido)
Disolución de sacarosa 0,25M
3-MÉTODO EXPERIMENTAL:REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
3.1.Obtención del extracto libre de células:
Disgregamos 25 g de levadura en un mortero. Lo colocamos en un erlenmeyer y añadimos 50 ml de NaHCO3 0,1M. Agitamos y tapamos con algodón para meterlo en en una estufa seca a 40 ºC durante 24h. Así conseguimos que las celulas de levadura se lisen y posteriormente centrifugamos la mezcla a 4000 rpm durante 15 min.
Se recoge elsobrenadante (invertasa) y se guarda en un refrigerador. El volumen del sobrenadante fue de : 45 ml.
3.2.Preparación de la curva patrón de azúcar invertido.
Preparamos la siguiente serie de tubos de ensayo:
Tubo nº
Disolución de azucar invertido (0,0025M)
Agua
Sacarosa
0,25M
Ac.3,5-dinitrosalicílioco
0
----
2ml
----
2ml
1
0,1 ml
0,9 ml
1ml
2ml
2
0,2 ml
0,8 ml
1ml
2ml
3
0,4 ml
0,6 ml
1ml
2ml
4
0,6 ml
0,4 ml1ml
2ml
5
0,8 ml
0,2 ml
1ml
2ml
6
1,0 ml
----
1ml
2ml
El tubo nº 0 es el blanco y contiene sólo 2ml de agua (sin azucar invertido) y con los 2 ml del ácido.
El color aparecerá al calentar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 4 min. Posteriormente diluimos hasta 10 ml con agua destilada y leemos la absorbancia a 450nm frente al tubo blanco. Con estos datos construimos la curva patrón.
Tubonº
Absorbancia
540nm
Azúcar invertido (moles/ml)
1
0,036
0,025
2
0,089
0,050
3
0,185
0,100
4
0,273
0,150
5
0,392
0,200
6
0,495
0,250
3.3. Determinación de la dilución óptima para el ensayo enzimático.
Del sobrenadante se preparan distintas diluciones para saber saber cual es la concentración adecuada para realizar el ensayo. Se preparan las siguientes diluciones:
1:10, 1;50, 1:100, 1:150 , 1:200,1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:500
De estas diluciones se toma 1 ml. Admás se preparan dos tubos adicionales con 1ml de agua destilada y otro con 1ml de sobrenadante original. Añadimos a todos los tubos 1ml de tampón acetato 0,025 M pH 4,5 y dejamos 5 min a temperatura ambiente. Añadimos posteriormente de manera secuencial desde el tubo 0 1ml de sacarosa 0,25M, agitamos y dejamos a temperaturaambiente durante 15 min. Se añade 2 ml de ácido 3,5-dinitrosalicílico en el mismo orden en que se añadió la sacarosa. Metemos los tubos en agua hirviendo durante 4min de esta manera aparecerá el color. Enfriamos y diluimos hasta 10ml con agua destilada. Leemos la absorbancia de cada tubo a 540nm frente al tubo blanco (tubo nº 0). La absorbancia cercana a las 0,4 unidades será la dilución adecuada.Tubo 0
1ml de agua destilada
0
Tubo 1
1ml de sobrenadante original
xxxx
Tubo 2
1ml de dilución 1:10
3,080
Tubo 3
1ml de dilución 1:50
2,388
Tubo 4
1ml de dilución 1:100
1,064
Tubo 5
1ml de dilución 1:150
0,752
Tubo 5
1ml de dilución 1:200
0,502
Tubo 6
1ml de dilución 1:250
0,323
Tubo 7
1ml de dilución 1:300
0,539
Tubo 8
1ml de dilución 1:350
0,282
Tubo 9
1ml de dilución 1:400
0,160
Tubo 10
1ml de...