Invertasa

32. Estudio cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería.
Manuel Tena Aldave, Jesús V. Jorrín Novo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

En la presente práctica se plantea realizar un estudio cinético de la actividad invertasa, que comprenderá la determinación de velocidades inicialesasí como estudios del efecto de los siguientes factores en la actividad enzimática: 1) concentración del enzima; 2) pH, con establecimiento del rango de valores de pH en el que el enzima es activo y determinación del pH óptimo; 3) temperatura, con establecimiento del rango de valores de temperatura en el que el enzima es activo y determinación de la temperatura óptima, energía de activación yvalor del coeficiente de temperatura Q10; y 4) concentración de sustrato, con establecimiento del modelo cinético (michaeliano o cooperativo) y determinación de los parámetros cinéticos del enzima.

Palabras clave: ecuación de Eadie-Hofstee, ecuación de Hill, ecuación de Lineweaver-Burk, representación de Arrhenius. Abreviaturas empleadas (por orden alfabético de abreviatura). A.O.= abscisa en elorigen; DNS: dinitrosalicílico; Int= intersección con el eje =0Y; Km: constante de Michaelis; Pte= pendiente; Vmax: velocidad máxima.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1. Determinación de velocidades iniciales La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado ó sustrato transformadofrente al tiempo) en el tiempo cero (Fig. 1). Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir otros factorescomo el aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación del enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción.

1

[P] 10 8 Concentración 6 4 2 0 0 0,2 0,4 Tiem po

[S]

Figura 1. Curva de progreso de una reacción enzimática.Obsérvese cómo, inicialmente, se produce una disminución de sustrato, o aparición de producto, que es lineal con el tiempo

0,6

0,8

1.2. Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática De forma general, la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo, según: v = Vmax[S]/(Km + [S]) = k'[E0] Vmax =kcat [E0]

1.3. Efecto del pH sobre la actividad enzimática La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reacción. La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig. 2). En el caso más general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es máxima se denomina pH óptimo; dicho pH no tiene porqué coincidir con el pHintracelular. La relación entre el pH y la actividad depende del comportamiento ácido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales ácidos y básicos, siendo su grado de disociación dependiente del pH, lo que determinará, entre otros aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad de unión del sustrato al centro activo del enzima (Km) yla capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los estudios cinéticos a diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de los enzimas y la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en la catálisis.
Pepsina Colinesterasa 10 8 Actividad 6 4 2 0 0 2 4 pH 6 8 10 Papaina Tripsina

Figura 2. Efecto del pH sobre la actividad de diversos...