Investigación

Laboratorio

12
Biología molecular
Objetivos
Al finalizar este laboratorio el estudiante podrá:
1.
2.
3.
4.
5.

Conocer los principios básicos de la técnica de electroforesis y su aplicación al análisis del ADN.
Describir las funciones de las enzimas de restricción.
Conocer cómo las enzimas de restricción cortan el ADN.
Realizar una electroforesis para separar los fragmentos deADN.
Observar el ADN cortado con diferentes enzimas de restricción.

INTRODUCCIÓN

L

a biología molecular sirve como herramienta potente para estudiar las relaciones evolutivas entre
los organismos de la tierra. Además, tiene muchas aplicaciones en varios campos como la
medicina y la agricultura.

El cortar el ADN con enzimas de restricción es frecuentemente el primer paso de losinvestigadores para
estudiar un gen. Estas enzimas, o endonucleasas, se extraen de organismos procarióticos (las bacterias),
donde actúan como un mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre a la célula.
Las enzimas de restricción (o endonucleasas) cortan o digieren el material genético a partir de una
secuencia que reconocen. La mayoría de estas secuencias son palindrómicas(secuencias que se leen
igual en ambas direcciones). Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son
extraídas. Su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por
primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican
la especie, la cuarta letra indica la cepa, y el número al final indicala cantidad de enzimas que se han
aislado de esa cepa, por ejemplo:

Comment [B1]: Un ejemplo de una
palabra palindrómica es “radar”. ¿Puede
pensar en otros ejemplos?

EcoRI

E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Al cortar el ADN, las enzimas de restricción pueden producir dos tipos de cortes: los cohesivos
(opegajosos) y los abruptos. Los cortes cohesivos o pegajosos cortan a manera escalonada, mientras que
los cortes abruptos cortan a las dos cadenas del ADN en el mismo lugar.

Luego de cortar al ADN con las enzimas de restricción, el ADN se puede usar para varias aplicaciones,
tales como:
•
•
•

Separación de fragmentos por electroforesis.
Generación de fragmentos para ser subclonados en losvectores apropiados, creando un ADN
recombinante.
Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
Nota: Un plásmido es una molécula circular de ADN que se encuentra en bacterias y
levaduras, y constituye una gran parte del material genético de este organismo. Un
bacteriófago es un virus que infecta bacterias.

Varios factores son críticos al trabajar con enzimas de restricción y estospueden afectar la actividad de las
mismas:
2

1. Pureza del ADN. El corte de la enzima de restricción depende de la pureza del ADN.
Contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol y altas concentraciones de sal
inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH.
3. Tipo de molécula de ADN. Si el ADN no posee una secuencia reconocida por la enzima de
restricción, esta enzima no podrácortar el material genético.
4. Amortiguador (buffer) adecuado. Un amortiguador o buffer provee el ambiente necesario
para que la enzima trabaje en condiciones óptimas.

PRINCIPIOS DE ELECTROFORESIS

Son varias las técnicas para estudiar la estructura del ADN (ácido desoxirribonucleico), pero la electroforesis
es posiblemente la más usada en el laboratorio debido a que es una técnicaefectiva, bastante fácil de hacer y
relativamente económica. Con esta técnica se separan macromoléculas (ej. proteínas y ácidos nucleicos) a
través de un flujo de corriente eléctrico.
Los fragmentos de una molécula de ADN cortada con enzimas de restricción se separan a través de la
electroforesis de acuerdo a las siguientes características:
•
•
•
•

El tamaño de la molécula o masa.
La forma o...