jajaja

Grau en Biotecnologia

Laboratori Integrat VI
Tècniques Instrumentals Avançades
CURS 2012/2013

Departament de Bioquímica i Biologia Molecular
Facultat de Ciències
Universitat Autònoma de Barcelona

Planificació:

Sessió 1:
Pràctica 1: Fraccionament subcel·lular per centrifugació diferencial......... 3
a) Homogeneïtzació del fetge de rata .................................... 4
b)Fraccionament per centrifugació diferencial ..................... 5
c) Determinació de la concentració de proteïna .................... 7

Sessió 2:
Pràctica 1 (cont.): Fraccionament subcel·lular per centrifugació diferencial.
d) Distribució d’enzims a la cèl·lula. Mesura d’activitats
enzimàtiques: .................................................................... 9
i)

Lactatdeshidrogenasa ....................................... 10

ii)

Glutamat deshidrogenasa .................................. 12

Sessió 3:
Pràctica 2: Aplicacions de la espectroscòpia i espectrofluorimetria
a) Titulació de les tirosines d'una proteïna ..............................................14
b) Estudi de la interacció del DNA amb el bromur d'etidi mitjançant
espectrofluorimetria.............................................................................18
c) Real Time quantitative PCR: obtenció d'una corba de fusió i càlcul de la
Tm del amplicó mitjançant fluorescència ............................................24

2

1. Fraccionament subcel·lular per centrifugació diferencial.
La funció metabòlica d'una cèl·lula es pot investigar en part mitjançant tècniqueshistoquímiques, per determinar regions que contenen una alta activitat d'un enzim
particular. Aquesta aproximació té les seves limitacions i és més convenient
separar els orgànuls i examinar les propietats de les partícules aïllades.
Quan les cèl·lules són sotmeses a intenses forces de cisalla, la membrana cel·lular
es trenca i els continguts s'alliberen al medi. Si es controlen les condicions del'homogeneïtzació és possible evitar que es trenquin els orgànuls, que després es
podran separar uns dels altres per centrifugació (recollida de materials en
suspensió en un medi líquid mitjançant un camp centrífug).
Hi ha diferents tipus de centrifugació: la centrifugació diferencial, la
centrifugació zonal, la centrifugació zonal en gradient de densitat i la
centrifugació isopícnica. A lacentrifugació diferencial, la mostra ocupa la totalitat
del tub. D’aquesta forma, en aplicar el camp centrífug, els components de major
coeficient de sedimentació avançaran a major velocitat i arribaran al fons del tub
abans que altres amb menor valor de s. En finalitzar la centrifugació, es poden
recollir dues fraccions, el sediment (al fons del tub), format pels components que
han arribat al fons,i l’anomenat sobrenedant, format pels components que resten
en dissolució o suspensió. Quan es desitja separar varis components d’una mostra,
la centrifugació diferencial se sol fer en diferents etapes. En elles es van fent servir
camps centrífugs creixents, durant períodes de temps cada vegada més grans.
Els objectius principals d’aquesta pràctica són: a) que us familiaritzeu amb lacentrifugació com a eina habitual al laboratori de Bioquímica per a la separació
3

dels components d’una barreja. Més concretament amb la centrifugació diferencial
que serà emprada per tal de separar diferents orgànuls cel·lulars de fetge de rata:
nucli, mitocondris i citosol; b) aprendre a determinar activitats enzimàtiques; c)
demostrar que enzims cel·lulars específics estan localitzats enregions específiques
de la cèl·lula. En concret serà possible demostrar que la glutamat deshidrogenasa
està associada a la fracció mitocondrial i la lactat deshidrogenasa amb la fracció
citosòlica. Per a evidenciar la localització subcel·lular d’aquest enzims
s’expressarà l’activitat específica de cada enzim en U/mg de proteïna per a cada
fracció subcel·lular.

1.a. Homogeneïtzació del fetge...