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Páginas: 17 (4239 palabras)
Publicado: 28 de agosto de 2012
FRAGMENTACIÓN CELULAR
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueletode actina, microtúbulos, poros nucleares, etc.).
Fases:
* Preanalítica: Obtención preparación preliminar de la muestra hasta llegar al laboratorio
* Analítica: o de aplicación de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe
* Postanalítica: Validación técnica del informe analítico.
Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :* Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
* Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presenciade algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.).
Técnicas de rotura de células y tejidos
El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condicionesque permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogenización más comunes son :
La purificación de cada uno de los principales organelos subcelulares representóun gran logro en la Biología celular al hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metabólicas.
La purificación se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. Las células deben estar suspendidas en una solución con pH y concentración de sales apropiada. Normalmente se emplea sacarosa isotónica (0,25%) o una combinación de salessimilar a las de la célula.
El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:
1. HOMOGENIZACION
Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células. Células noanexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y posteriormente de las células con el fin de obtener una mezcla fluida en la cualestén todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos métodos físicos.
Homogenizador de Esferas
Fragmentación celular por acción del choque de las esferas de vidrio con las células.
* Tamaño de esferas:
* 0.1 mm: Bacterias, esporas.
* 0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células tripsinizadas.
* 1.0, 2.5 mm:Cerebro, músculo, piel, hojas.
La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasa-líquido.
Homogenizador de émbolo y tubo
Potter, Potter-Elvehjem, Dunce, Ten Broeck.
Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado.
Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de...
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueletode actina, microtúbulos, poros nucleares, etc.).
Fases:
* Preanalítica: Obtención preparación preliminar de la muestra hasta llegar al laboratorio
* Analítica: o de aplicación de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe
* Postanalítica: Validación técnica del informe analítico.
Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :* Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
* Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presenciade algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.).
Técnicas de rotura de células y tejidos
El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condicionesque permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogenización más comunes son :
La purificación de cada uno de los principales organelos subcelulares representóun gran logro en la Biología celular al hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metabólicas.
La purificación se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. Las células deben estar suspendidas en una solución con pH y concentración de sales apropiada. Normalmente se emplea sacarosa isotónica (0,25%) o una combinación de salessimilar a las de la célula.
El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:
1. HOMOGENIZACION
Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células. Células noanexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y posteriormente de las células con el fin de obtener una mezcla fluida en la cualestén todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos métodos físicos.
Homogenizador de Esferas
Fragmentación celular por acción del choque de las esferas de vidrio con las células.
* Tamaño de esferas:
* 0.1 mm: Bacterias, esporas.
* 0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células tripsinizadas.
* 1.0, 2.5 mm:Cerebro, músculo, piel, hojas.
La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasa-líquido.
Homogenizador de émbolo y tubo
Potter, Potter-Elvehjem, Dunce, Ten Broeck.
Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado.
Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de...
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