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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:
Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
Primera Sesión.Extracción de DNA
Extracción de ADN de E. coli
1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche (14-16 h) a
37°C con agitación constante de >200 rpm.
2. Colocar 1 mL delcultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Agregar 250 μL de agua desionizada estéril al paquete celular.
6.Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células
(aproximadamente 30 s).
7. Agregar 250 μL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
8. Agitar vigorosamentedurante 30 s utilizando un vortex.
9. Agregar 250 μL de cloroformo.
10. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
11. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
12. Recuperar la fase acuosa(fase superior, aprox. 225 μL) y colocarla en otro tubo de 1.5
mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este
Instituto Politécnico Nacional
Unidad ProfesionalInterdisciplinaria de Biotecnología
Laboratorio de Biotecnología Molecular
Manual elaborado por Paola Berenice Zárate Segura, César Agustín Jiménez Sierra, Jesús Agustín Badillo Corona y Claudio
GaribayOrijel
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precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la
muestra e inhibir reacciones posteriores.
13. Agregar 225 μL de cloroformo.
14. Agitar vigorosamentedurante 30 s utilizando un vortex.
15. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
16. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 μL) y colocarla en otro tubo de 1.5
mL, teniendo las mismasprecauciones que en el paso 12.
17. Agregar 20 μL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
18. Agitar en vortex 20 s.
19. Agregar 440 μL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
20. Centrifugar a...