Jsdh
Páginas: 13 (3156 palabras)
Publicado: 31 de enero de 2013
LABORATORIO AVANZADO
DE FISIOLOGÍA VEGETAL
Curso 2006-2007
Módulo de cultivo in vitro
Comisión Docente de Fisiología Vegetal
Departamento de Biología
Universidad Autónoma de Madrid
Francisca F. del Campo
Soledad Sanz Alférez
Luis E. Hernández
Cultivo in vitro de explantos de tabaco. Análisis deTransgenicidad
Introducción
Diversas plantas de interés agroalimentario, ornamental o manipuladas genéticamente, han de propagarse o regenerarse vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es preciso emplear técnicas de propagación vegetativa para erradicar infecciones por virus y para introducir variaciones genotípicas que aumenten la calidad de los productos. Estas técnicas se conocengenéricamente como cultivo in vitro.
Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas.
Elmedio inorgánico más empleado es la mezcla de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y células.
En la práctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtención de callos de explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones deauxina/citoquinina que determinan, según los casos, mayor desarrollo de la parte aérea o mayor desarrollo de la raíz.
Una de las aplicaciones del cultivo in vitro, como se ha indicado, es la regeneración de plantas trasngénicas. Dado que los eventos de transformación genética solo afectan a unas pocas células del material vegetal manipulado, es preciso incluir un GEN DE SELECCIÓN. Estoes: un gen que codifica una enzima capaz de detoxificar una sustancia letal para las células vegetales. Así, muchas plantas transgénicas portan como gen de selección el gen de resistencia a los antibióticos kanamicina y neomicina (neomicina fosfotransferasa, nptII). La presencia de este gen de selección o resistencia se puede detectar en las plantas de tabaco cultivadas mediante dos experimentos:i) propagación del material vegetal en un medio de cultivo in vitro suplementado con kanamicina, y ii) detección del transgen mediante PCR a partir de DNA genómico.
NOTA IMPORTANTE:
Hay que evitar en lo posible la contaminación de los medios de cultivo por bacterias u hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles.
Se trabajará muy cerca de la llama delmechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse bien las manos con jabón y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %.
SI NO CUIDAIS ESTE ASPECTO OS PODEIS ENCONTRAR CON VUESTRO EXPERIMENTO TOTALMENTE INFECTADO POR ORGANISMOS INDESEABLES!!!!
Asimismo, es necesario ser muy pulcros al esterilizar el materialvegetal que se va a cultivar in vitro. Por favor, seguid muy atentamente las indicaciones del guión de prácticas y las recomendaciones que hagan los profesores.
1ª PARTE: Propagación de plantas de tabaco tipo silvestre y transgénicas en medio con kanamicina
1.1. Material para el cultivo in vitro
Material vegetal
Plantas cultivadas en un substrato orgánico. Se emplearán plantas que han sidopreviamente cultivadas en nuestro laboratorio de tabaco (Nicotiana tabacum), de las que disponemos una línea silvestre (no manipulada genéticamente) y otra transgénica (que sobreexpresa un gen que codifica MnSOD). Estas plantas se crecieron en un substrato de turba más perlita durante mes y medio.
Disoluciones para esterilizar los tejidos
De lavado: etanol 70%
Esterilizadora: hipoclorito...
DE FISIOLOGÍA VEGETAL
Curso 2006-2007
Módulo de cultivo in vitro
Comisión Docente de Fisiología Vegetal
Departamento de Biología
Universidad Autónoma de Madrid
Francisca F. del Campo
Soledad Sanz Alférez
Luis E. Hernández
Cultivo in vitro de explantos de tabaco. Análisis deTransgenicidad
Introducción
Diversas plantas de interés agroalimentario, ornamental o manipuladas genéticamente, han de propagarse o regenerarse vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es preciso emplear técnicas de propagación vegetativa para erradicar infecciones por virus y para introducir variaciones genotípicas que aumenten la calidad de los productos. Estas técnicas se conocengenéricamente como cultivo in vitro.
Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas.
Elmedio inorgánico más empleado es la mezcla de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y células.
En la práctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtención de callos de explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones deauxina/citoquinina que determinan, según los casos, mayor desarrollo de la parte aérea o mayor desarrollo de la raíz.
Una de las aplicaciones del cultivo in vitro, como se ha indicado, es la regeneración de plantas trasngénicas. Dado que los eventos de transformación genética solo afectan a unas pocas células del material vegetal manipulado, es preciso incluir un GEN DE SELECCIÓN. Estoes: un gen que codifica una enzima capaz de detoxificar una sustancia letal para las células vegetales. Así, muchas plantas transgénicas portan como gen de selección el gen de resistencia a los antibióticos kanamicina y neomicina (neomicina fosfotransferasa, nptII). La presencia de este gen de selección o resistencia se puede detectar en las plantas de tabaco cultivadas mediante dos experimentos:i) propagación del material vegetal en un medio de cultivo in vitro suplementado con kanamicina, y ii) detección del transgen mediante PCR a partir de DNA genómico.
NOTA IMPORTANTE:
Hay que evitar en lo posible la contaminación de los medios de cultivo por bacterias u hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles.
Se trabajará muy cerca de la llama delmechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse bien las manos con jabón y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %.
SI NO CUIDAIS ESTE ASPECTO OS PODEIS ENCONTRAR CON VUESTRO EXPERIMENTO TOTALMENTE INFECTADO POR ORGANISMOS INDESEABLES!!!!
Asimismo, es necesario ser muy pulcros al esterilizar el materialvegetal que se va a cultivar in vitro. Por favor, seguid muy atentamente las indicaciones del guión de prácticas y las recomendaciones que hagan los profesores.
1ª PARTE: Propagación de plantas de tabaco tipo silvestre y transgénicas en medio con kanamicina
1.1. Material para el cultivo in vitro
Material vegetal
Plantas cultivadas en un substrato orgánico. Se emplearán plantas que han sidopreviamente cultivadas en nuestro laboratorio de tabaco (Nicotiana tabacum), de las que disponemos una línea silvestre (no manipulada genéticamente) y otra transgénica (que sobreexpresa un gen que codifica MnSOD). Estas plantas se crecieron en un substrato de turba más perlita durante mes y medio.
Disoluciones para esterilizar los tejidos
De lavado: etanol 70%
Esterilizadora: hipoclorito...
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