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9.2 Manipulación de ácidos nucleicos.
9.2.1 Purificación y separación de DNA y de RNA.
La purificación de DNA es un paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Los métodos de purificación de DNA se clasifican en dos grandes categorías, según pretendan purificar DNA cromosómico o DNA plasmídico. La purificación de DNA plasmídico es la base de cualquier experimento de clonaciónmolecular. El problema principal que hay que resolver es la separación del DNA plasmídico y DNA cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de “lisis alcalina”, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La purificación de RNA es otro paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Cuando se trabaja con células de mamífero existen dos posibilidades: purificar RNA total o mRNA(en base a la cola de poliA). La purificación de RNA es la base de la cuantificación de transcritos en estudios de expresión génica. En esta práctica purificaremos RNA mediante el método “TRI-REAGENTTM”. El DNA plasmídico se purificará a partir de bacterias portadoras y el RNA a partir de células humanas cultivadas en el laboratorio. Los ácidos nucleicos se separarán por tamaño medianteelectroforesis en geles de agarosa y se visualizarán por irradiación con luz UV en presencia de bromuro de etidio.


Métodos de separación.
Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los científicos abuscar técnicas, cada vez, más precisas.
Para elegir una técnica de separación, además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivosdel análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección específica).
El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dosgrandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos ocualitativos.
Es precisamente en las técnicas de separación en las que basaremos la revisión bibliográfica del presente trabajo, debido a su amplio uso en el campo de la Biotecnología, Biología Molecular y Bioquímica entre otras ramas de la investigación.
Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.
La cromatografía comprende unconjunto importante y diverso de métodos que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.
La cromatografía no solo permite laseparación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que...