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Materiales y métodos

1- Material fúngico.
Los hongos utilizados en este estudio fueron las cepas nativas de hongos de pudrición marrón (HPM) Paxillus panuoides 83 y Antrodia xantha uytfytfghvhgf







4- Capacidad de inmovilización de iones Cu (II) en la biomasa fúngica.

Las cepas que resultaron tolerantes y sensibles a iones Cu (II), seleccionadas en las etapas anteriores fueroncultivadas en medio sólido en presencia del metal para evaluar la capacidad de inmovilización en los micelios, como un posible mecanismo de destoxificación o tolerancia. Las cepas fúngicas tolerantes se cultivaron a 0,01 y 1 mM, mientras que las cepas sensibles sólo se cultivaron en la concentración más baja de Cu (0,01 mM). Las cepas fueron inoculadas sobre una membrana de celofán e incubadas enoscuridad a 24 ( 1oC por un periodo de 30 días.
Luego del periodo de incubación las membranas de celofán fueron retiradas junto con los micelios desde la superficie de los medios de cultivo, y luego de su separación de las membranas los micelios fueron cuidadosamente lavados con agua desionizada y el peso fresco (mg) de cada uno fue determinado. Posteriormente, los micelios fueron secados enestufa a 60 ºC hasta alcanzar peso constante (mg). Los micelios secos y molidos fueron llevados a laboratorios especializados (BIOLECHE) para la cuantificación de Cu por espectrofotometría de absorción atómica (Equipo UNICAM 929 AA Spectrometer), luego de calcinación a 500 ºC y disolución con HCl de las muestras, mediante el método con llama de aire-acetileno por aspiracion directa. (Sadzawka A,Métodos de Análisis de Tejidos Vegetales, 2007). Los resultados fueron expresados en ppm de Cu en base al peso seco de los micelios.


5- Efecto de los iones Cu (II) en la capacidad lignocelulolítica de las especies tolerantes, cultivadas en medio líquido.

Las cepas fúngicas tolerantes a iones Cu (II) en medio líquido (ítem 3), fueron cultivadas nuevamente en medio líquido EM al 0,5%, pH 4,5, enpresencia de diferentes concentraciones de Cu para evaluar su efecto sobre la producción de las enzimas lignocelulolíticas. El medio EM fue esterilizado en autoclave a 1,2 kg/cm2 y 120ºC por 15 min, y luego que alcanzó una temperatura aproximada de 50°C, bajo cámara de flujo laminar fueron adicionados los iones Cu (II) a concentraciones finales de 0,01, 0,5 y 1 mM. Luego de la disolución de losiones metálicos, 20 mL de cada medio EM contendiendo las diferentes concentraciones de Cu fueron adicionados en matraces Erlenmeyer de 120 mL, los que posteriormente fueron inoculados con un disco de agar-micelio (5 mm diámetro) de las cepas tolerantes, obtenidos a partir de las placas stock. Matraces conteniendo medio EM sin adición de iones Cu (II), fueron inoculados de la misma forma con lascepas fúngicas, constituyendo los cultivos control. Los matraces inoculados conteniendo medio EM, con y sin iones Cu (II), fueron incubados bajo condiciones estáticas en cámara de crecimiento a 24 ± 1 ºC durante 5, 10, 15 y 20 días. En estos periodos de tiempo los extractos fúngicos fueron recuperados por filtración al vacío utilizando papel filtro previamente seco y pesado. La masa micelial retenidaen el papel filtro fue llevada a estufa de secado a 60ºC para la determinación del peso seco (mg). En los extractos filtrados fueron determinados la variación de pH, la concentración de proteínas totales y la actividad de las enzimas lignocelulolíticas. Cada matraz fue inoculado en triplicado para cada condición de cultivo y cepa fúngica.


6- Determinación de proteínas y enzimaslignocelulolíticas.
La cuantificación de proteínas extracelulares totales fue realizada siguiendo la metodología de Bradford (1976), mezclando 0,1 mL del extracto fúngico con 1,0 mL del reactivo de Bradford (Coomassie Brilliant Blue). La mezcla fue incubada por 15 min a temperatura ambiente y luego la absorbancia a 595 nm fue medida utilizando un espectrofotómetro UV/Visible (…). La concentración de...