KIT DE PROTEINAS

KIT DE PROTEINAS

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Conla técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación deproteínas, la transferencia y la detección.
Western Blot: Visión General
 Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química.





 Electroforesis en gel de Acrilamida
Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio(SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas.





 Transferencia electroforética a una membrana
Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas.



Hibridación del Anticuerpo
La membrana con las proteí- nas inmovilizadas debetratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma especí- fica al anticuerpo primario, proporcionando una forma dedetección.




Detección de las Bandas
Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión deluz. Dicha luz puede ser detectada en una pelí- cula de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario.


Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En primer lugar, las proteínas, serevisten con carga negativa, mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se pueden separar en el gel según su tamaño.
Medición de proteína total
Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. La cantidad de proteína óptimaa cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. A menudo, para determinar la carga de proteína apropiada, se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas.
2. Realización de Western Blotscuantitativos o semi-cuantitativos. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma, se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación.
Descripción del método
Existen diversos métodos para medir la proteína total de una...