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Fundamentos y aplicaciones de la Biología Molecular y la Bioinformática

Laboratorio Práctico I: Purificación y Análisis de Acidos Nucleícos.


Objetivo: - Extracción y Purificación de ARNdesde tejido y cultivos de células.
- Determinación de la concentración y la pureza del ARN aislado mediante técnicas espectrofotométricas.
- Analisis de la integridad del ARN aislado medianteelectroforesis convencional .

MATERIALES.

Tejido de salmón, tejido de Trucha o linea celular en cultivo de Salmón.
Homogenizador de Tejido.
PBS (Buffer Fosfato Salino) pH 7.4.
Pipetas 10 mLPro-pipetas
TRIZOL (Cuidado con su manipulacion!!!. Trabajar bajo campana de Flujo Contiene fenol compuesto altamente tóxico y mutageno). (ver manual de TRIZOL anexado antes de comenzar el Práctico).Cloroformo (Cuidado con su manipulacion!!!. Trabajar bajo campana de Flujo. Altamente volatil, inflamable e irritante).
Alcohol Isopropilico (Cuidado con su manipulacion!!!. Altamente volatil, eirritante).
Etanol 75%.
Agua nanopure esteril.
Puntas con filtro p1000, puntas con filtro p200, puntas con filtro p10
Micropipetas p1000, p200, p20, p10
Tubos de 1,5 mL esteriles, Tubos 0,6 mlesteriles.
Espectrofotometro
Microcentrifuga
Vortex
Bufer de carga 6X para acidos nucleicos.
Gel Agarosa 1%
Cámara electroforesis
Fuente de poder
Solucion de Tinción de Bromuro de Etidio 0.5 g/mLTransiluminador con capturador de Imágenes.
Recipientes con Hielo






DESARROLLO DEL PRÁCTICO.











1.- Aislamiento de ARN total desde Tejido

.- Homogenize 100 mg(aproximadamente) de tejido de trucha o salmón, con 800 L del reactivo TRIZOL hasta obtener una mezcla homogenea.

.- Incube las muestras por 10-15 minutos a temperatura ambiente. Agregue 0,2 mL decloroformo (DEPC) por mL de Trizol usado y agite vigorosamente por 15 segundos, luego incube a temperatura ambiente por 3 minutos.

.- Centrifugue las muestras a 12.000 g por 10 minutos a 4ºC.

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