la clonacion

INVESTIGAR:
Nuevas técnicas de manipulación del ADN
Las enzimas de restricción
Uno de los avances más importante en los inicios de la biología molecular, fue el descubrimiento de las endonucleasas de restricción, es decir de enzimas que pueden cortar el ADN y que tienen la ventaja de que lo cortan en sitios concretos. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimas que estas bacterias usanpara destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacteriófagos. Con las enzimas, la bacteria puede degradar este ADN foráneo sin degradar su propio ADN.
Varias de ellas fueron identificadas en la década del 70 y siguieron descubriéndose otras posteriormente, aisladas de diferentes cepas bacterianas. La ventaja de estas enzimas es que reconocen un sitio para cortar, pueden ser undiseño de 4, 6, 8 bases, pero tienen que estar organizadas con una secuencia exacta y no otra. Por ejemplo, la enzima que se llama EcoR1 (porque se aisló de la bacteria Escherichia coli, que reside normalmente en el intestino), solo corta si encuentra la secuencia GAATTC. Si hay una base que está cambiada ya no corta.
Estas enzimas de restricción, entonces permiten cortar el ADN en sitiosespecíficos. Algunas de ellas cortan dejando extremos cohesivos que se pueden pegar nada más que por complementariedad de bases. Esto quiere decir que un extremo que generó una enzima y otro que generó la misma enzima aunque provengan de moléculas de ADN diferentes, se pueden unir y generar lo que se llamó inicialmente un ADN recombinante.
La clonación
Recordemos que los plásmidos son moléculas de ADNcirculares, pequeñas, que se encuentran en las bacterias por fuera del ADN cromosómico. Dado que se adaptan a albergar otro pedazo de ADN, se abre la posibilidad de poner un gen determinado (o un tramo de ADN determinado) en un plásmido circular, generando un ADN recombinante. En estas circunstancias el plásmido está funcionando como un “vector”: es capaz de llevar el trozo de ADN (que denominamosinserto) mantenerlo, tenerlo aislado, lo cual era uno de los propósitos de la manipulación genética.
El plásmido, que naturalmente está en las bacterias, puede volver a las bacterias y crecer con ellas. Se pueden transformar bacterias con plásmidos que llevan inserto. Una vez dentro de la bacteria, el plásmido se replica con ella. Así se consigue que el trozo de ADN además de estar aislado, seaamplificado y se obtienen rápidamente muchas copias idénticas. Decimos que el trozo de ADN fue clonado. Teniendo una cantidad mayor de ADN del tramo de interés éste puede ser secuenciado, cortado con enzimas de restricción u otras manipulaciones.

Los vectores
Con el paso del tiempo surgió la necesidad de que los vectores albergaran pedazos más grandes. El tamaño medio del inserto de un plásmidoes de 10000 bases. El objetivo de clonar genes eucariotas completos o de secuenciar un genoma exige poder incluir trozoas de mayor tamaño. De esta manera, uno de los grandes polos de desarrollo que surgieron fue loa obtención de mejores vectores, vectores que albergaran pedazos grandes en lo posible genes enteros. El primer paso fue pasar a utilizar como vectores los propios bacteriófagos (virusque infectan bacterias); y después se desarrollaron otros, que fueron construcciones, combinaciones, de trozos de plásmido, de bacteriófago, de cromosoma de levadura, etc. Siempre buscando vectores que llevaran mayores insertos y que fueran eficientes. Así surgen muchos, como por ejemplo los BACs (bacterial artificial chromosome) en los que están contenidos actualmente los trozos de ADN del genomahumano.
Así se pudo por ejemplo clonar un gen que tiene alrededor de un millón de pares de bases que es el gen de la distrofia muscular, el gen se pudo tener entero para poderlo estudiar y eventualmente expresar. De esta forma se puede también tener todo el genoma cortado en pedazos y clonado (cada pedazo inserto en un vector) para posteriormente estudiarlo. Esto es justamente una genoteca:...