La Inhibicio n De La Degradacio n Enzima tica De La

Degradación
Enzimática De La
Interface AdhesivoDentina
Inhibition of Enzymatic
Degradation of AdhesiveDentin Interfaces
J. De Munck
Grupo de Investigación del Departamento de Odontología
Conservadora, Facultad de Odontología, Patología Oral y Cirugía
Maxilofacial de la Universidad Católica de Lovaina, Lovaina,
Bélgica

Las enzimas endógenas (metaloproteinasas de la matriz o MMP)
se liberan yactivan mediante procedimientos adhesivos,
exponiendo la dentina a la actividad colagenolítica (Pashley et
al., 2004; Nishitani et al., 2006) y así inician la degradación de
enlace adhesivo-dentina. Estas enzimas hidrolizan colágeno
dentro de la capa híbrida y comprometen la durabilidad de la
unión.
Las metaloproteinasas de matriz son enzimas que pueden
descomponer colágeno, que se encuentra en losespacio
intercelular de los tejidos. Son relevantes en la participación de
procesos como curación de heridas, la angiogénesis y la
metástasis de células tumorales.

Existe la hipótesis de que la adición de
inhibidores de MMP al primer de los
adhesivos puede evitar la degradación
enzimática endógena, mejorando así
la durabilidad de la unión adhesivodentina.
Un inhibidor no específico MMP(clorhexidina) y un inhibidor específico
de MMP 2/9 (SB-3CT) fueron mezclados a los primers de grabado y
enjuague y un adhesivo de autograbado, ambos considerados como
adhesivos “estándar de oro” dentro de su respectivas categorías.

Material y Metodos

Zimografía
• Método para la detección y localización de la actividad
enzimática en secciones de tejido.

• Terceros molares humanos (obtenidos dedonantes <25 años,
después del consentimiento fundamentado APROBADOS por la
Comisión de Ética Médica de la Universidad Católica de Lovaina)
se almacenaron en un 0,5% de cloramina en el agua (4 ° C) y se
usan 1 mes después de la extracción.

• Bloques de dentina coronal se prepararon ampliamente por
medio de un recortador de yeso, sierra de diamante de baja
velocidad, y fresa de diamante, para evitar lacontaminación con
proteínas de esmalte o tejido pulpar.

• Este "medio“ de dentina (Boushell et al., 2008) se pulverizó
en un molino analítico refrigerado por agua.
• Las enzimas fueron extraídas de la dentina en polvo con 60
μL de solución SDS (100 mM Tris/HCl [pH = 6.8], 4% de
dodecilsulfato de sodio, 20% de glicerol, 200 μg/ml de azul
de bromofenol como tinte), esta solución sirve como
tampónde electroforesis de carga para la electroforesis en
gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)
• Las muestras se separaron en geles de poliacrilamida al
7,5%, al que se añadió 0,1% de gelatina y copolimerizado.

• Las muestras fueron separadas a 4 ° C durante
aproximadamente 16 horas a 85 V. (Electroforesis)
• Después de la electroforesis, los geles se lavaron con Triton
X-100para eliminar SDS, se incubaron para el desarrollo de
la actividad enzimática, se tiñeron con azul brillante de
Coomassie, y se destiñeron en metanol / ácido acético.
• La actividad propia de la gelatinasa se detectó como bandas
sin teñir sobre un fondo azul. Junto con cada prueba,
encontraron un marcador de proteínas MMP-9 estándar con
pesos moleculares conocidos (Van den Steen et al., 2002,
2006)para identificar los pesos moleculares.

• Se llevó a cabo el mismo procedimiento para evaluar la
liberación de enzimas en el grabado, mezclando
directamente después de la molienda, 50 mg de polvo de
dentina con 0,035 ml de Acido Fosforico (H3PO4) al 35%
durante 30 segundos.
• Grabado ácido se terminó mediante dilución con 1 ml de
100 mM Tris / HCl y breve centrifugación (1 min, repetido 3veces).
• Asimismo, el polvo de ácido-grabado se mezcló a mano con
0,035 ml con el primer del adhesivo de tres pasos grabado y
lavado OptiBond FL (SDS-Kerr, Orange, CA, USA) por 30
segundos.

• Posteriormente, los monómeros del adhesivos se eliminaron por
dilución en acetona pura y breve centrifugación (1 min, repetido
3 veces).
• Se omitió el tratamiento con ácido fosfórico para evaluar el
potencial...