La Inmunohistoqu Mica

La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica o IHC tinción de secciones de tejido, es tal vez la técnica de inmunotinción más comúnmente aplicado. Mientras que los primeros casos de tinción IHC utilizan colorantes fluorescentes, ahora se utilizan otros métodos no fluorescentes utilizando enzimas tales como la peroxidasa y la fosfatasa alcalina. Estas enzimas son capaces de catalizar reaccionesque dan un producto de color que es fácilmente detectable por microscopía de luz. Alternativamente, los elementos radiactivos se pueden utilizar como etiquetas, y la reacción inmunológica pueden ser visualizados por autorradiografía.
Preparación de tejidos o la fijación es esencial para la preservación de la morfología celular y la arquitectura del tejido. Fijación inapropiada o prolongada puededisminuir significativamente la capacidad de unión del anticuerpo. Muchos antígenos se pueden demostrar con éxito en secciones de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina. Sin embargo, algunos antígenos no sobrevivirán incluso cantidades moderadas de fijación de aldehído. En estas condiciones, los tejidos deben ser rápidamente fresco congelado en nitrógeno líquido y se cortó con uncriostato. Las desventajas de las secciones congeladas incluyen la mala morfología, pobre resolución a ampliaciones superiores, dificultad en el corte sobre secciones de parafina, y la necesidad de almacenamiento congelado. Alternativamente, las secciones de vibratome no requieren que el tejido que se procesa a través de disolventes orgánicos o calor alta, que puede destruir la antigenicidad, ointerrumpido por congelación y descongelación. La desventaja de las secciones de vibratome es que el proceso de corte es lento y difícil con los tejidos blandos y mal fija, y que las marcas de vibraciones o líneas vibratome a menudo son evidentes en las secciones.
La detección de los antígenos se puede mejorar drásticamente mediante métodos de recuperación de antígeno que actúan al romper algunos de losenlaces cruzados de proteínas formadas por la fijación para descubrir sitios antigénicos ocultos. Esto se puede lograr por calentamiento durante distintos períodos de tiempos o el uso de digestión con enzimas.
Una de las principales dificultades con la tinción IHC es superar fondo específico o no específico. Optimización de los métodos y tiempos de fijación, el tratamiento previo con agentes debloqueo, incubando los anticuerpos con alta concentración de sal, y la optimización de tampones de lavado post-anticuerpos y los tiempos de lavado son todos importantes para la obtención de la inmunotinción de alta calidad. Además, la presencia de controles positivos y negativos para la tinción, son esenciales para la determinación de especificidad.
La citometría de flujo
Un citómetro de flujo sepuede utilizar para el análisis directo de las células que expresan una o más proteínas específicas. Las células se inmunotiñeron en solución utilizando métodos similares a los utilizados para la inmunofluorescencia, y luego analizadas por citometría de flujo.
La citometría de flujo tiene varias ventajas sobre IHC incluyendo: la capacidad para definir poblaciones de células distintas por su tamaño ygranularidad; la capacidad de puerta de las células muertas; mejora de la sensibilidad, y el análisis de varios colores para medir varios antígenos simultáneamente. Sin embargo, la citometría de flujo puede ser menos eficaz en la detección de poblaciones de células extremadamente raras, y hay una pérdida de relaciones arquitectónicas en la ausencia de una sección de tejido. La citometría de flujotambién tiene un alto coste de capital asociado con la compra de un citómetro de flujo.
Western Blot
Western Blot permite la detección de proteínas específicas a partir de extractos elaborados a partir de células o tejidos, antes o después de las etapas de purificación. Las proteínas se separan generalmente por tamaño utilizando electroforesis en gel antes de ser transferido a una membrana...