La ltima etapa del proceso de obtenci n de organismos transg nicos consiste en detectar si el gen for neo se ha integrado al genoma

Páginas: 6 (1449 palabras) Publicado: 9 de junio de 2015
La última etapa del proceso de obtención de organismos transgénicos consiste en detectar si el gen foráneo se ha integrado al genoma, y si se expresa. Esto exige la extracción del material genético, y el empleo de técnicas de biología molecular, para su identificación que ya han sido mencionadas. Cabe también hacer referencia a la manera como es obtenido el ADN de los diferentes organismos.Puede obtenerse ADN de cualquier célula viva, a excepción de los eritrocitos humanos que son anucleados. La técnica es básicamente la misma para todo tipo de célula. En primer lugar se rompen las células ya sea por métodos mecánicos o químicos, y se extraen las proteínas mediante incubación con una proteinasa. A continuación se separan el ADN y el ARN del resto de constituyentes de la célulautilizando una mezcla con fenol. Los ácidos nucleicos se distinguen de las restantes sustancias bioquímicas en que no se disuelven en fenol. Tras la centrifugación, el fenol se separa de la fase acuosa. Las proteínas y las grasas permanecen en el fenol, pero el ADN y el ARN se encuentran en la fase acuosa. Los restos de fenol pueden eliminarse con cloroformo. El fenol se disuelve en el cloroformo, mientrasque los ácidos nucleicos permanecen en la fase acuosa. Posteriormente la adición de etanol hará que el ADN se vuelva insoluble y forme un precipitado visible, semejante a un trozo de algodón, el cual puede ser fácilmente extraído y disuelto en una solución de agua y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), listo para su análisis. El ADN de un peso molecular inferior, como el de plásmidosbacterianos, no puede ser extraído de la misma manera y debe recuperarse por centrifugación. El ARN contaminante  puede entonces eliminarse mediante tratamiento con una ARNasa.
La concentración de ADN en una solución puede determinarse mediante espectrofotometría. El ADN absorbe la luz a una longitud máxima de onda de 256 nm. Una solución de ADN de 1 mg/ml tiene una densidad óptica a 256 nm. Las proteínasabsorben la luz a una longitud máxima de onda de 280 nm. El índice de densidades ópticas a 256 y a 280 nm es un indicador de la pureza de la solución.
 
Extracción del ADN en tejidos vegetales.
Los agregados vegetales como polisacáridos, fenoles y compuestos secundarios son el principal problema encontrado en la extracción y purificación del ADN vegetal, estos  pueden deteriorar el ADN e inhibirla acción de la enzima Taq polimerasa. Las hojas de diversas especies de plantas  poseen  niveles  variados de alcaloides, esteroides, flavonoides, glucósidos cianogénicos, gomas, taninos, resinas y algunos ácidos que pueden comprometer la extracción del ADN.
De modo general, el protocolo de extracción más utilizado para las diferentes especies vegetales es el CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio),que normalmente integra un buffer para estabilizar el pH en torno de 8, una sal para disociar las proteínas del ADN, un detergente para solubilizar las membranas y auxiliar en la inactivación de algunas enzimas. Los detergentes deben romper las membranas celulares para que ocurra la liberación del ADN. Algunos protocolos usan SDS (dodecil sulfato de sodio) como detergente, otros usan CTAB y otrosusan sarcosil. 
Actualmente existen numerosos protocolos que permiten extraer el ADN de diferentes especies y tejidos vegetales. La diversidad de técnicas manifiesta la variabilidad en la composición química de los vegetales, que impide el desarrollo de un protocolo universal. Sin embargo, los fundamentos de cada etapa son comunes a todos los métodos.
El siguiente método de extracción fue tomadodel artículo Producción e identificación de cultivos transgénicos. Diego Ariel Meloni; Julia Andrea Lescano. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Argentina.
Primero, el material vegetal es congelado mediante la adición de nitrógeno líquido, y macerado para producir la ruptura de las membranas y paredes celulares. El polvo así obtenido es resuspendido en un buffer de extracción, a pH 8 -...
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