La ltima etapa del proceso de obtenci n de organismos transg nicos consiste en detectar si el gen for neo se ha integrado al genoma
La concentración de ADN en una solución puede determinarse mediante espectrofotometría. El ADN absorbe la luz a una longitud máxima de onda de 256 nm. Una solución de ADN de 1 mg/ml tiene una densidad óptica a 256 nm. Las proteínasabsorben la luz a una longitud máxima de onda de 280 nm. El índice de densidades ópticas a 256 y a 280 nm es un indicador de la pureza de la solución.
Extracción del ADN en tejidos vegetales.
Los agregados vegetales como polisacáridos, fenoles y compuestos secundarios son el principal problema encontrado en la extracción y purificación del ADN vegetal, estos pueden deteriorar el ADN e inhibirla acción de la enzima Taq polimerasa. Las hojas de diversas especies de plantas poseen niveles variados de alcaloides, esteroides, flavonoides, glucósidos cianogénicos, gomas, taninos, resinas y algunos ácidos que pueden comprometer la extracción del ADN.
De modo general, el protocolo de extracción más utilizado para las diferentes especies vegetales es el CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio),que normalmente integra un buffer para estabilizar el pH en torno de 8, una sal para disociar las proteínas del ADN, un detergente para solubilizar las membranas y auxiliar en la inactivación de algunas enzimas. Los detergentes deben romper las membranas celulares para que ocurra la liberación del ADN. Algunos protocolos usan SDS (dodecil sulfato de sodio) como detergente, otros usan CTAB y otrosusan sarcosil.
Actualmente existen numerosos protocolos que permiten extraer el ADN de diferentes especies y tejidos vegetales. La diversidad de técnicas manifiesta la variabilidad en la composición química de los vegetales, que impide el desarrollo de un protocolo universal. Sin embargo, los fundamentos de cada etapa son comunes a todos los métodos.
El siguiente método de extracción fue tomadodel artículo Producción e identificación de cultivos transgénicos. Diego Ariel Meloni; Julia Andrea Lescano. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Argentina.
Primero, el material vegetal es congelado mediante la adición de nitrógeno líquido, y macerado para producir la ruptura de las membranas y paredes celulares. El polvo así obtenido es resuspendido en un buffer de extracción, a pH 8 -...
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