Lab Enzimas Y Proteínas

Introducción.
Las proteínas son polímeros lineales de sustancias orgánicas, y se encuentran en las células animales y vegetales. Estas se dividen según su función en: estructurales y funcionales. En las funcionales se encuentran las más importantes, las enzimas. (T. José y G. Amando. Bioquímica estructural: Conceptos y test)
Las enzimas son proteínas complejas que producen un cambio químicoespecífico en todas las partes de un sistema biológico. Su funcionamiento y estabilidad se ve regulado bajo condiciones de T° y pH particulares de cada enzima. (V. Luis. Enzimas: Qué son y para qué sirven)
En las plantas se encuentra la enzima amilasa, que es sintetizada por el endosperma durante la germinación para formar las proteínas, degradan el endosperma y rompen la testa de la semilla (C.Rebeca y colaboradores. Amilasas.), por lo que es muy abundante en poáceas, como la cebada.
La alfa-amilasa es una enzima capaz de romper enlaces puente de hidrogeno, hidrolizando enlaces alfa 1-4 de los polisacáridos, entre ellos el almidón presente en las semillas de cebada. Como característica particular de esta enzima atribuible al cofactor Ca+2 se puede mencionar que resiste temperaturasentre 70° y 90° C, y que a demás trabaja a pH menores de 6. (H. Silva y H. Duchens. Guía Laboratorio nº 1)

Objetivo.
• El objetivo principal de este laboratorio es extraer e identificar la acción de la enzima alfa-amilasa.
• Reconocer isoformas de la enzima alfa-amilasa, a través de estudios llevados a cabo en semillas de cebada.
• Generar experiencia en el uso y manejo de material yde laboratorio.

Materiales y métodos (con modificaciones de Guía Laboratorio nº1).
Técnica de film printing: Para visualizar experimentalmente la acción de la enzima, se mantuvo en contacto secciones cortadas de 10 semillas de cebada con el medio de ensayo que contiene agar al 1 % y almidón al 1 % en una placa de petri, donde se produjo un intercambio de la enzima contenida en la semillacon la placa. Esto se realizó a una temperatura de 28°C, con el objetivo de proporcionar el medio óptimo a la enzima para su acción. Se dejó actuar la enzima durante una hora para lograr la máxima acción. Una vez transcurrido este tiempo, las semillas se retiraron y se realizó una tinción con lugol al 10% e inmediatamente se lavó, esto permitió diferenciar las zonas en donde la enzima degradó elalmidón presente en el medio de ensayo.

Para el método de la electroforesis, el primer paso realizado consistió en obtener un homogeneizado de 20 semillas de cebada en un mortero y se colocó en 3 tubos eppendorf, el cual posteriormente se centrifugó (10.000 rpm) en una centrifuga refrigerada por 15 min., para lograr la precipitación de las proteínas y así se separó el sobrenadante que contienea la alfa-amilasa, cambiándolo a otros 3 tubos eppendorf. Posteriormente se sometieron a un baño seco a 70ºC otros 15 min. y luego se colocaron en hielo, lo que permitió la degradación de otras enzimas que pudieran interferir en el experimento. Luego fueron centrifugados (8.000 rpm) por 5 min. con el fin de obtener una muestra más pura de alfa-amilasa la cual se encuentra en el nuevo sobrenadanteque fue traspasado a otros 3 tubos eppendorf. De este último sobrenadante se extrajeron 80μL, los que fueron utilizados para realizar la electroforesis nativa por una hora aproximadamente, la cual consiste en ver la acción y grado de purificación de la amilasa en geles de poliacrilamida que son sometidos a un campo eléctrico, el que hace migrar la enzima de acuerdo a su carga y masa. Se retiró elzimograma el cual fue teñido con KI-I2 al 2% para poder visualizar el resultado.

Como parte de otro experimento, se realizó una dilución de la enzima obtenida en el experimento anterior en agua destilada para ver, en el mismo medio de ensayo utilizado en el film printing, la intensidad del halo formado a distintas concentraciones de alfa-amilasa. Se dividió el medio en 4 sectores, en el cual...