lab genetica

Laboratorio genética
Extracción de DNA (TP1)
Obtención de muestra
1.
2.
3.

Frotado bucal durante un minute
Agitar el cepillo en buffer TE (Tris + EDTA) (1 ml)  desprende las células
Centrifugar para que se peguen las células y descartar el sobrenadante

Pre- tratamiento (para muestras de tejido fijadas e incluidas en parafina)
4.
5.
6.

Lavados con xileno (para sacar la parafina)
Lavados conetanol absoluto
Calor (produce la lisis celular)

Lisis celular
7.

8.

9.

Métodos físicos
a. Disrupción mecánica con homogeneizadores o tijeras
b. sonicación
Agentes químicos
a. Detergentes: SDS o CTAB (mas agresivo)
b. EDTA: es un quelante que desestabiliza la membrana
c. Digestión enzimática con proteinasa K
d. RNasas, amilasas (son mas específicas)
Agregado de Buffer de digestión:
a. NaCl: paraque el DNA sea soluble en solución acuosa
b. Tris – HCL
c. SDS: para lisar la membrana
d. EDTA: desestabiliza las células epiteliales disueltas

Purificación de DNA
10. Agregado de LiCl, NaCl para apantallar las cargas negativas del DNA para que sea soluble solución acuosa. El LiCl es
mas efectivo para apantallar las cargas negativas de los fosfatos del DNA por su menor tamaño.
11. Extracciónorganica, separación de fases
a. Fenol-cloroformo (tóxico)
b. SEVAG isoamílico-cloroformo 1:24 (buenos resultados)
c. tomar la fase acuosa y pasarla a otro tubo
d. Etanol frio absoluto para precipitar el DNA
e. Centrifugar y descartar por inversión
f. Etanol 70% para eliminar las impurezas (restos de sales)
g. Centrifugar y descartar el sobrenadante
h. Secado en bloque térmico
i. Resuspención enbuffer TE (Tris + EDTA) para preservar el DNA

Visualización y cuantificación de resultados
12. Fluorometría
a. Mas preciso para cuatificar
Parcial laboratorio genética

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b. No puedo determinar la contaminación ni degradación
13. Espectrofotómetro  nanodrop
a. Permite ver la contaminación
b. No se ve la degradación
c. Se cuantifica midiendo la absorvancia 260/280
14. Gel
a.Semi-cuantificación
b. Permite ver la degradación (por el PM del DNA)

Gen amelogenina (TP2)
El gen AMG posee 360 pb en X y una deleción de 200 pb en Y por lo tanto es de 160 pb. Al amplificar por PCR y luego
correr un gel se puede diferenciar la muestra de un hombre de la de una mujer porque en la muestra femenina se espera
obtener una banda de 360 pb y en hombre, dos bandas una de 360 pb correspondiente alcromosoma X y otra de 160 pb
correspondiente al cromosoma Y.

Muestras a amplificar


Extraccion de mucosa bucal



Control positivo



Control negativo

¿Cómo hacer una pre-mix?  CLAVE!
Pre- mix
Buffer (10X)
MgCl2 (50mM)
dNTP’s (10mM 10000μM)
Primer (25μM)
Taq Pol (10μl)
H2O (diferencia)
DNA (50 ng/μl)

Concentración final
1X
1,5 mM
0,2 mM
0,25 μM
2.8U
100ng/tubo

Para 1 tubo
1,5 μl
0,45 μl
0,3μl
0,15 μl
0,42 μl
10,18 μl
2 μl

Para 10 tubos (multiplico x 10)
15 μl
4,5 μl
3 μl
1,5 μl
4,2 μl
101,8 μl
20 μl

Cálculos para 1 tubo de 15μl:


Buffer: 10x . v1 = 1x . 15μl  v1=1,5 μl




MgCl2: 50 mM . v1 = 1,5mM . 15 μl  v1=0,45 μl
dNTP’s: 10.000 μM . v1 = 200 μM . 1,5 μl  v1= 0,3 μl



Primer: 25 μl . v1 = 0,25 μM 15 μl  v1=0,15 μl



Taq Polimerasa: 100 U/ μl . v1 = 2,8 U/ μl . 15 μl 0,42 μl

Para realizar la PCR se utiliza:


Buffer (para mantener el pH)



Taq polimerasa



MgCl2 El Mg es cofactor de la Taq polimerasa



Agua



dNTPs



DNA



Primers (AMG)

El programa de amplificación


Desnaturalización inicial a 95°C



Desnaturalización a 95°C

Parcial laboratorio genética

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

Annealing 52°C



Extensión 72°C



Extensión final 72°C paraasegurarme que las
moléculas tengan la longitud completa
Luego de la amplificación se conservan las muestras a
4°C. perfil de la reacción 

DNA molde
Factores que lo modifican:


Calidad fuente de donde se obtuvo



Concentración  número de copias



Secuencia  % GC y restricciones estructurales que impidan el ingreso o unión de primers o de DNA molde

Polimerasa
La polimerasa Taq platinium...