laboratorio 1

PRÁCTICA Nº 02
EXTRACCION DE ADN EN MÚSCULO
1. INTRODUCCIÓN:
La extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico) es un proceso vital con muchas aplicaciones científicas. En la investigación y la medicina, sus usos incluyen secuenciación del ADN, la detección de los virus y las bacterias, y la investigación de enfermedades y trastornos con base genética. En el campo de la ciencia forense, esutilizado para la identificación de los muertos y los vivos, así como el análisis de la escena de crimen. A pesar de sus resultados sofisticados. La extracción de ADN comienza con la obtención de una muestra de ADN. Dado que todos los organismos vivos contienen ADN, las opciones disponibles para la muestra son prácticamente infinitas, y la elección por lo general se relaciona directamente con eltema del objeto de estudio. El ADN humano es fácil de obtener por pequeños toques en el interior de la mejilla con un hisopo de algodón. Las muestras de plantas pueden ser adquiridas cortando una sección del material de origen.

2. OBJETIVOS:
Realizar la extracción de ADN y obtener los datos de concentración y pureza del ADN.
Manipular materiales y equipos en la realización de práctica.
Conocerlas palabras y procedimientos que se desconocen.
Discutir el tema en grupo y concluir en una opinión.

3. MATERIALES
Muestra (musculo)
Bisturí
Papel toalla
Papel aluminio
Alcohol
Eppendorf
Balanza analítica
Pipetas
Micropipetas
Centrifuga
Vortex
Tips
Congeladora -80 ºC




4. PROCEDIMIENTOS
En primer lugar se consiguió la muestra que vendría a ser el musculo (de alpaca).Se coloco en la congeladora a -80ºC para que después retirada la muestra sea mas fácil los pequeños cortes.
Se peso en un eppendorf de 1.5 mL, 125 mg de pequeños segmentos de musculo, luego se añadió 340 µL de tampón de lisis que sirve para poder degradar la membrana del tejido muscular, posteriormente es colocado en el vortex para una mejor combinación del tampón de lisis con los pequeñosfragmentos de musculo, después se añadió 10µL de proteinasa K de 20 mg/mL(que es un buffer de lisis del material celular, la cual degrada los péptidos de membrana plasmática y nuclear, facilitando la liberación de ADN), se agito y se añadió 1µL de Rnasa (es una enzima que degrada el ARN en nuestra práctica sirve para evitar la presencia de el ARN) de 20 mg/µL y se agito la solución.
Se incubo conagitación a 65 ºC durante hora y media con la finalidad de obtener mejores resultados para la lisis de las células.
Tras la incubación se añadió 350 µL (1 volumen) de fenol: cloroformo: alcohol isoamilico 25:24:1, se agito invirtiendo el eppendorf para la combinación y se centrifugo a 6000 r.p.m durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Se saco el eppendorf y se noto la separación en dos partes unaliquida (contenido con ADN) y otra solida (contenida con restos de proteínas).
Se transvaso la parte superior o acuosa a otro eppendrof de 1.5 mL y se añadió 250 µL (1 volumen) de cloroformo: alcohol isoamilico 24:1 y se desecho la parte inferior.
Se agito por inversión y se volvió a centrifugar a 6000 r.p.m. durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Se volvió a repetir el paso anterior.
Seañadió a la aparte acuosa 875 µL (2.5 volúmenes) de etanol a -20 ºC, se invierte el eppendorf despacio y se logra observar la aparición de la “medusa” de ADN.
Se deja reposar durante 20 minutos en la congeladora a -80 ºC para la precipitación de ADN.
Se centrifuga a 10000 r.p.m durante 5 minutos a 4 ºC
Se tira el sobrenadante o parte acuosa, y se añadió 1mL de etanol al 70 % a -20 º C
Se vuelvea centrifuga a 10000 r.p.m durante 5 minutos a 4 ºC
Se tira el sobrenadante o parte acuosa y se seca el precipitado a 37 ºC durante 15-30 minutos
Se añade tampón T10E1.
Se disuelve el precipitado a a37 ºC durante 30 minutos y luego a 4 ºC hasta que esté completamente disuelto.
Se guarda a – 80 ºC

Finalmente se estimamos la concentración de ADN, midiendo la absorvancia a λ=260 nm,...