Laboratorio Bioquimica Enzimologia

Trabajo práctico 5
Enzimología







Integrantes: Profesor encargado: David Contador
- Florencia Martínez 5/11/2012
- Paula Valdés
- Bárbara Spencer Bioquímica

I. Objetivos

Generales:
- Estudiar el efecto e influencia de algunos factores físicos (PH, temperatura y concentración del producto) sobre la actividad enzimática
- Caracteriszar cinéticamente a la enzimafosfatasa alcalina

Específicos:
- Realizar una curva de calibración para valores estándares de concentración de p- nitrofenol
- Estudiar la cinética de la enzima determinando su Km y Vmax
- Determinar el efecto del PH sobre la acción de la enzima
- Determinar el efecto de la temperatura sobre la acción enzimática
- Determinar el efecto de la concentración del producto sobre la acción de laenzima


II. Resultados

A) Preparación de la curva de calibración de p- nitrofenol:

pNP (uM) A405 nm A 405 nm correguida
0 0,065 0
20 0,134 0,069
40 0,358 0,293
60 0,509 0,444
80 0,661 0,596
100 0,797 0,732
120 0,907 0,842



















B) Estudio cinético de la fosfatasa alcalina:

pNPP (mM) A 405 nm A 405 nm Concentración pNP (uM) V0 (umolespNP/minutos)
0 0,056 0 0 0
0,05 0,245 0,189 29,78 1,98
0,1 0,363 0,307 45,531 3,02
0,5 1,231 1,175 159,52 10,63
1 1,986 1,93 258,8 17,25
5 2,991 2,935 391,1 26,07
10 2,144 2,088 279,65 18,64


-Cálculo de concentración de producto, a partir de curva de calibración de pNP y cálculo de velocidad inicial para cada reacción en umoles/minuto.

1. pNPP 0 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
0 = 0,0076x –0,0374
0 pNP (uM) = x

Vo = (0 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 0 umoles de pNP/minuto


2. pNPP 0,05 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
0,189 = 0,0076x – 0,0374
29,78 pNP (uM) = x

Vo = (29,78 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 1,98 umoles de pNP/minuto

3. pNPP 0,1 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
0,307 = 0,0076x – 0,0374
45,531 pNP (uM) = x

Vo = (45,531 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 3,02 umoles de pNP/minuto4. pNPP 0,5 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
1,175 = 0,0076x – 0,0374
159,52 pNP (uM) = x

Vo = (159,52 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 10,63 umoles de pNP/minuto

5. pNPP 1 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
1,93 = 0,0076x – 0,0374
258,8 pNP (uM) = x

Vo = (258,8 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 17,25 umoles de pNP/minuto

6. pNPP 5 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
2,935 = 0,0076x – 0,0374
391,1 pNP (uM) = x

Vo =(391,1 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 26,07 umoles de pNP/minuto



7. pNPP 10 mM:
y = 0,0076x – 0,0374
2,088 = 0,0076x – 0,0374
279,65 pNP (uM) = x

Vo = (279,65 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 18,64 umoles de pNP/minuto



Estimación de Vmax y Km:
A partir del gráfico de la curva de saturación, estimamos el valor aproximado de la velocidad máxima, que en nuestro caso es de aproximadamente 26umoles de pNP/minuto. Por otra parte, el valor aproximado de la Km (constante de Michaelis), nos indica la concentración de sustrato cuando la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima. Así, siendo Vmax/2 = 13, la Km obtenida es de aproximadamente 0,6.
1/ pNPP (1/mM) 1/ Vo (1/(uM/min))
0 0
20 0,5
10 0,33
2 0,094
1 0,057
0,2 0,038
0,1 0,0536C) Efecto del pH sobre la actividad enzimática:

PH A 405 nm A 405 nm correguida Concentración pNP (uM) Velocidad (uM/minutos) Logaritmo Velocidad
9,6 (blanco) 0,063 0 0 0 1
4 1,187 1,124 152,8 10,18 1,008
7 1,092 1,029 140,3 9,35 0,97
9,6 1,969 1,906 255,7 17,04 1,23







D) Efecto temperatura sobre la actividad enzimática:

Temperatura (ºC) A 405 nm A 405 nm correguidaConcentración pNP (uM) Velocidad (uM/minutos)
37 (blanco) 0,06 0 0 0
0 0,687 0,627 87,42 5,82
37 2,207 2,147 287,42 19,16
60 0,969 0,909 124,5 8,3
100 0,268 0,208 32,289 2,15

Cálculos:

1. 37ºC (blanco):
y = 0,0076x – 0,0374
0 = 0,0076x – 0,0374
0 pNP (uM) = x

Vo = (0 uM (pNP))/ 15 mins
Vo = 0 umoles de pNP/minuto

2. 0ºC:
y = 0,0076x – 0,0374
0,627= 0,0076x – 0,0374...