Laboratorio De Microbiologia Determinación De Azucares Reductores Por Dns Tinción De Gram Determinación De Biomasa Por Turbidez

Practica de Microbiología general Preparación de medios de cultivo, siembra, identificación morfológica y cuantificación de microorganismo
Preparado por: Ing. Carlos Álvarez Revisado y complementado: Adriana Ruiz

1. Introducción: Durante el desarrollo de esta práctica se trabajará con dos microorganismos empleados en la producción de bioetanol, La levadura S. cereviseae y la bacteria Z.mobilis. Durante el proceso de fermentación los nutrientes que se encuentran en el medio de cultivo, se transforman debido a la acción de las células en tres productos principales: etanol, CO2 y nuevas células (Biomasa). Todos los elementos teóricos necesarios para el desarrollo de esta práctica ya fueron adquiridos en el curso de fundamentos de biotecnología. El objetivo es completar el aprendizajeteórico de manera práctica respecto a la preparación medios de cultivo, determinación de características microbiológicas (colonias, morfología, etc), distinguir microorganismos por tinción de Gram y cuantificación de biomasa espectrofotométricamente. Tiempo estimado de desarrollo de la práctica: El día 1 se debe disponer de aproximadamente 4 horas continuas y el día 2 de aproximadamente 2 horascontinuas. 2. Materiales 2.1 Equipos de laboratorio día 1: Incubadora, 2 Erlenmeyeres de 250ml y 100ml, Asas para inoculación, mechero de alcohol, cámara bioseguridad y autoclave. Equipos de laboratorio día 2: Microscopio (porta y cubre objetos), Centrifuga, tubos Ependorf y espectrofotómetro. 2.2 Reactivos día 1: Extracto de levadura, Glucosa, Extracto de malta, peptona, células de Z. mobilis y S.cereviseae (Colonia aisladas en caja de petri). Reactivos día 2: Agua destilada, Colorantes de Gram y solución salina isotónica (0.9% p/v). 3. Procedimiento 3.1 Preparación de medios de cultivo: Se preparan dos tipos diferentes de medios de cultivo, uno para Z. mobilis (tabla 1) y otro para S. cereviseae (tabla 2). Para el medio sólido: Se debe pesar la cantidad necesaria de nutrientes requeridospara un volumen total de cultivo de 150 ml, por lo tanto una vez se pesen y solubilicen los nutrientes, estos se aforan a un volumen total de 150 ml. En la tabla 1 y 2 se presentan las concentraciones requeridas para preparar un medio liquido, con el fin de preparar un medio sólido se debe agregar 20g/l de agaragar, antes de aforar el volumen. Fundamentos de Biotecnología Universidad Nacional deColombia-Medellín, Octubre 2010 1

Tabla 1. Composición del medio de cultivo estándar (SM) para Z. mobilis ZM4. Sustancia Concentración (g/l) D-Glucosa 20 Extracto de levadura 5

Tabla2. Composición del medio de cultivo M4 para S. cereviseae. Sustancia Concentración (g/l) D-Glucosa 10 Extracto de levadura 3 Extracto de Malta 3 Peptona 5

Una vez preparados los dos medios de cultivo, se rotulanlos erlenmeyer y se calientan en baño María a 80°C durante 5-10min para que el agar se solubilice. Pare el medio líquido: Se debe pesar la cantidad necesaria de nutrientes requeridos para un volumen total de cultivo de 50 ml, por lo tanto una vez se pesen y solubilicen los nutrientes, estos se aforan a un volumen total de 50 ml. Para la preparación de este medio no es necesario agregar agar. 3.2Esterilización: Después de preparar los medios de cultivo, estos se esterilizan en el autoclave protegiendo la boquilla de los erlenmeyers con un tapón de algodón. Adicionalmente se esterilizan 12 cajas de Petri, y las asas de inoculación que se encuentren disponibles. La esterilización se lleva a cabo a 121°C (15 psi) durante 15 min, sin embargo el autoclave requiere alrededor de 40 min. en llegaral valor de temperatura deseada. 3.3 Inoculación: Una vez esterilizados los medios de cultivo sólidos se dejan enfriar hasta aproximadamente 60°C (hasta que sea tolerable al tacto), después se sirven las cajas de Petri. Se requieren aproximadamente 25ml de medio por cada caja de Petri, por lo tanto se sirven 6 cajas con medio M4 y 6 cajas con medio SM. Los medios servidos en las cajas de Petri...