Laboratorio de Microbiología Aplicada

ANEXO
Curva tipo de glucosa por el método de DNS (Miller, 1959)

1. Organizar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla.
Tubo
µL de solución patrón de Glucosa (2mg/mL)
µL de aguadestilada
1
0
500
2
40
460
3
50
450
4
60
440
5
70
430
6
80
420
7
90
410
8
100
400
9
125
375
10
150
350

2. Realizar lo anterior por triplicado.
3. Agregar 1 ml de DNS acada uno de los tubos
4. Incubar en agua en ebullición durante 5 min, posteriormente retirar y enfriar
5. Leer en espectrofotómetro a 575 nm calibrando con el tubo 1.
6. Con los datos obtenidoscalcular la media y la desviación estándar en cada experimento realizado, así como el coeficiente de correlación de los datos.
7. Elaborar las curvas patrón graficando Absorbancia contra concentración.8. Determinar la ecuación de la recta para cada curva.

ANEXO
Determinación de la actividad enzimática de invertasa

1.- Filtrar al vació el medio YPD con Aspergilus niger. El sobrenadante seráconsiderado como el extracto crudo enzimático, y será utilizado para la cuantificación de la actividad.

2. Organizar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla.
Tubo
1
2
3
4
ECE
25 µL25 µL
25 µL
25 µL
Sustrato
475 µL
475 µL
475 µL
475 µL
DNS
1000 µL
1000 µL
1000 µL
1000 µL

3. El tubo 1 no se incuba e inmediatamente se agrega 1 ml de DNS.
4. Los tubos 2, 3 y 4 seincuban durante 5 min a 37ºC para que la enzima lleve a cabo la reacción, posteriormente se retiran y se agrega 1 ml de DNS.
5. Todos los tubos que contienen DNS se colocan en agua en ebullición por 5minutos, se dejan enfriar para su lectura.
6. Leer en espectrofotómetro a 575 nm calibrando con el tubo 1.
7. Utilizando la ecuación de la recta de la curva tipo de glucosa, determinar losmicrogramos de glucosa liberados y con estos datos calcular la actividad enzimática considerando que una Unidad de invertasa como la cantidad de enzima necesaria para liberar un micromol de glucosa por...