laboratorio

TRABAJO PRÁCTICO N°4:
“CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO”











Alumnos:
Cristobal Besnier S.
Viviana García B.Dennisse Morales N.



INTRODUCCIÓN



La cromatografía es un método muy utilizado que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. En cromatografia la fase estacionaria está fijada en un lugar, ya sea la columna o en una superficieplana. Tambien la fase móvil se mueve sobre la fase estacionaria o a través de ella, arrastrando consigo la mezcla de analitos. La fase movil puede ser un gas, un líquido o un fluído supercrítico.[1]

La cromatografía de intercambio iónico, fue desarrollada inicialmente por W. Cohn. En este método las moléculas de soluto se separan basándose en las diferencias de comportamiento ácido-base. Paraeste proceso la columna se llena con una resina sintética que contiene grupos cargados fijos. Existen dos clases principales de resinas de intercambio iónico: intercambio catiónico e intercambio aniónico. Los aminoácidos se separan habitualmente mediante columnas de intercambio catiónico rellenas con partículas sólidas de una resina de poliestireno sulfonada que se ha equilibrado previamente conuna disolución de NaOH, en donde sus grupos sulfónicos ácidos se hallan totalmente cargados con Na+. [2].

Las resinas que más se emplean para el intercambio iónico son la dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y la carboximetil (CM)-celulosa. La DEAE-celulosa está cargada positivamente y por lo tanto actúa uniéndose con moléculas cargadas negativamente; constituye pues un intercambiador aniónico.La elusión puede tener lugar en una serie de pasos sucesivos mediante la adición secuencial de amortiguadores diferentes o de forma continua mediante la adición de una solución que cambie de continua su fuerza iónica o pH, esto es, un gradiente.[3]





















OBJETIVOS



1) Utilizar la cromatografía de intercambio en la determinación de albúmina.

2) Tenerpresente la buena utilización de la columna, sin que ésta se seque o se quiebre.

3) Cuantificar la albúmina utilizando los métodos de cromatografía de intercambio iónico y la determinación de acuerdo a la absorción UV, mediante un espectrofotómetro.

4) Determinar la concentración de albúmina a través de la Ley de Lambert-Beer.MATERIALES Y MÉTODOS



En este laboratorio, debido a que el montaje de la columna requería de gran tiempo, ésta ya se encontraba montada cuando se comenzó el práctico; la cual estaba compuesta por DEAE-celulosa y un tampón fosfato de sodio a 20mM y pH 7,0. Se agregó nuevamente el tampón para dejar escurrir la muestra sin que la columna se secara, después de agregar 15mL del tampón se colocó 1mLde la muestra de albúmina y se dejó que ésta penetrara la columna, después se lavaron las paredes con el tampón, finalizando esta parte se agregaron 10mL de NaCl, por concentración de está [0,05M], [0,1M], [0,2M], [0,5M] de NaCl, haciendo así la recolección de la albúmina en 7 tubos de 1,5mL por cada una de las concentraciones de NaCl.

A continuación en el práctico se midió la absorbancia a280nm de la albúmina en 13 celdas (cada una de éstas contenía 3,0 mL de la recolección, por ende 2 tubos de 1,5 mL) correspondientes de acuerdo a las concentraciones de NaCl, para finalizar se lavó la columna con tampón.

Materiales utilizados:

-Columna (jeringa de 10mL).
-DEAE-celulosa (Dietilaminoetil celulosa)(fase estacionaria de la columna).
-Tampón de fosfato de sodio 20mM pH 7,0....