laboratorio

LABORATORIO DE INGENIERIA BIOQUIMICA III
PRACTICA NO 1
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LA ENZIMA LACASA

INTRODUCCIÓN
En trabajos de bioquímica, frecuentemente es necesaria la determinación de la concentración de proteínas. Para tal objetivo existen diversos métodos y para la elección de uno de ellos habrá que tener en cuenta lo siguiente:
La cantidad total de proteínadisponible
La concentración de la solución
La presencia de compuestos que interfieran en el ensayo
La rapidez con la que se necesita el resultado
En 1972, Folin y Ciocalteau pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que fue la base del método descrito después de Lowry en 1951. En el primer paso se forma el complejo de Biuret, dando la reducción de Cu2+ del complejo, para obtener Cu+ y enlacespeptídicos oxidados. En el segundo paso, el Cu+ reduce el reactivo de Folin-Ciocalteau, dando lugar a varios compuestos de color azul que se detectan a una longitud de onda de 750nm. El componente activo de este reactivo es el ácido mixto fosfomolibdotúngstico. La reducción de este reactivo se manifiesta por la pérdida de uno, dos o tres átomos de oxígeno del tungstato y del molibdato,obteniéndose las especies de color azul. Además de la reacción del complejo Biuret formado en la primera etapa, también contribuyen a la reducción del reactivo las cadenas laterales de algunos aminoácidos (Tyr, Trp y en menor medida Cys-Cys, y Cys-His). La susceptibilidad a la composición aminoacídica de las proteínas es una desventaja del método, además algunos agentes reductores utilizados en laspreparaciones de las proteínas (-mercaptoetanol, ditiotreitol, EDTA) interfieren en el ensayo. El procedimiento de Lowry esta sujeto a la interferencia por compuestos como el ión potasio, magnesio, EDTA, Tris, reactivos con grupos tiol y carbohidratos. Otros métodos para cuantificar la cantidad proteica es el método de Biuret, que es sensible a todos los anteriores compuestos además de amonio y glicerol.Un procedimiento que elimina los problemas que los dos métodos anteriores, además del tiempo del proceso, es el método de Bradford, que esta basado en las propiedades químicas del principal compuesto, que es el azul brillante de Coomassie G-250, y el cual forma un complejo colorido azul al unirse a las proteínas y rojo en su forma libre. El complejo tiene un alto coeficiente de extinción molar yque se forma rápidamente (2 min) y que es estable por 1 h.

Para la obtención de enzimas intracelulares a partir de microorganismos, se pueden usar algunas técnicas para lograr la lisis celular, por ejemplo el rompimiento mecánico, presión celular, sonicación, choque osmótico y rompimiento químico. Los hongos microscópicos, poseen un sistema multienzimático sofisticado, que les permite desdoblarlos nutrientes. Este sistema enzimático sofisticado es capaz de romper enlaces altamente polimerizados. Las principales enzimas que son causantes esta despolimerización son la Manganeso peroxidasa, Lignino peroxidasa, superoxido dismutasa y la lacasa. Estas enzimas se encuentran en hongos con una capacidad ligninolitica avanzada.


OBJETIVO
Que el alumno aprenda a calcular la actividadespecifica, a través de la estimación experimental de la velocidad de reacción de la enzima lacasa de hongos.




MATERIALES

Papel seda
22
Tubos de ensayo (pequeños)

REACTIVOS
1
Gradilla para tubos

Fosfato de sodio monobásico
1
Probeta de 100 mL

Fosfato de sodio dibásico
4
Vasos de precipitados de 100 mL

NaCl
1
Micropipeta de 1000 L

Albumina de Huevo
1
Micropipeta de200L,

Agua destilada
1
Piceta con agua destilada

2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) (profesor)
1
Vortex

Reactivo de Bradford (profesor)
1
Espectrofotómetro

Enzima Lacasa MtL (profesor)
2
Celdas de Acrílico (profesor)

ALUMNOS
2
Pipetas Pasteur

Tijeras
1
Palangana

Franela

Puntas para Micropipeta (profesor)

Maskintape y Plumón con tinta Indeleble

PREPARACIÓN DE...