Laboratorio

Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación ala diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
MATERIAL USADO
ðUn vaso lavador
ðUn asa de siembra
ðUna gradilla con tubos de ensayo con el microorganismo en medio sólido (Agar como coloide.)
ðUna placa de Petri
ðPortaobjetos
ðMicroscopioMetodologia
En primer lugar encendemos el mechero, ya que para realizar cualquier estudio de una muestra bacteriana, debemos usar la técnica aséptica para evitar la contaminación de la muestra.
Usamos un asa de siembra, aparato fundamental en la preparación de frotis y cultivos. La calentamos al rojo en el mechero y a continuación cogemos una gota de agua el asa y la depositamos en elportaobjetos que previamente habremos preparado. Volvemos a esterilizar el asa y con otra mano abrimos un tubo de ensayo tapado con un algodón donde se encuentra el inoculo a sembrar. Con cuidado introducimos el asa, evitando que el asa mate por excesivo calor a los microorganismos, dando unos golpecitos dentro del tubo y mojando el asa en el tubo un poco.
Cerramos el tubo y colocamos el inóculo en elportaobjetos, haciendo un frotis con él. Fijamos a la llama cuidadosamente con ligeros pases con el mechero y dejamos secar.

Recoger muestras.
Hacer el extendido en espiral.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) yesperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar hasta 8 a 15 segundos aproximadamente(parte critica de la coloracion)
Enjuagar con agua.
Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 45 segundos. Este tintedejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
Explicación
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yodurode potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en lamisma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que lasGram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta...