las mejor tarea de yohan

45. Clonación del DNA amplificado mediante PCR
Gabriel Dorado Pérez
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

Aunque ya han comenzado a desarrollarse técnicas basadas en el análisis
de moléculas individuales, el estudio de los ácidos nucleicos requiere
generalmente un paso previo de amplificación. Eneste capítulo se aborda
la clonación del fragmento de DNA correspondiente al gen araA de
Salmonella typhimurium previamente amplificado mediante PCR.
Básicamente, se trata de insertar el DNA amplificado mediante PCR (DNA
pasajero o inserto) en un plásmido apropiado (DNA vector o vehículo)
mediante un proceso denominado ligación, previa linearización (digestión
o restricción). Para que estaconstrucción (DNA recombinante o
manipulado) persista en el tiempo y se amplifique in vivo es necesario
introducirla en un hospedador (del inglés “host”) apropiado, como E. coli
(que previamente se ha hecho “competente” para favorecer la entrada del
DNA recombinante) y finalmente poder seleccionar aquellas células
portadoras del DNA recombinante utilizado en el proceso.
Palabras clave:antibiótico, célula
hospedador, huésped, transgénico.

competente,

colonia

transformante,

Abreviaturas
empleadas.
DMSO:
dimetil
sulfóxido;
DNA:
ácido
desoxirribonucleico; IPTG: isopropiltio–β–D–galactósido; LB: medio rico LuriaBertani; OD: densidad óptica; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; PEG:
polietilén glicol; RNA: ácido ribonucleico; PM: peso molecular; TSS: medio parainducir estado de competencia; X-Gal: 5–bromo–4–cloro–3–indolil–β–D–
galactósido.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Aunque ya han comenzado a desarrollarse técnicas basadas en el análisis
de moléculas individuales, el estudio de los ácidos nucleicos requiere
generalmente un paso previo de amplificación. Tradicionalmente, dicho
proceso se ha llevado a cabo in vivo, mediante la construcción debibliotecas
(del inglés “libraries”) génicas o de cDNA. Típicamente, el DNA de interés es
cortado con una o varias enzimas de restricción y ligado a un vector como el
fago lambda, con el que luego se infecta un cultivo de Escherichia coli que se
hace crecer en medio sólido. Las bibliotecas génicas o de cDNA contienen
representaciones de los miles de genes y fragmentos de DNA de la muestra departida generados tras su restricción. Para clonar propiamente y poder analizar
el DNA de interés, es necesario identificarlo en dicha biblioteca. Ello se
consigue rastreándola mediante el uso de sondas o anticuerpos específicos
que reconozcan secuencias presentes o proteínas expresadas por la biblioteca.
1

Finalmente, los clones de interés pueden ser subclonados en plásmidos (parafacilitar su manejo) y secuenciados. Puede ser también interesante estudiar la
expresión génica del DNA clonado en vectores de expresión apropiados. Esta
estrategia, aunque eficiente, es muy laboriosa y requiere una gran inversión de
tiempo, oscilando típicamente entre meses y años.
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido
simplificar la clonación clásica (léase, invivo) del DNA e incluso prescindir
completamente de ella en algunos casos. De hecho, podría considerarse la
PCR como una especie de “clonación in vitro”, ya que el material genético se
amplifica en el tubo de ensayo y no en una bacteria. El proceso es muy rápido,
llevándose a cabo en tan sólo unas horas (o incluso minutos). Una vez que el
DNA ha sido amplificado mediante PCR, se dispone desuficiente número de
copias del fragmento como para proceder a su análisis de restricción,
identificación por Southern o secuenciación. La PCR puede realizarse a partir
de una biblioteca génica o de cDNA, pero también directamente de DNA
genómico, RNA, cDNA, e incluso células completas.
Conviene sin embargo aclarar que la PCR no sustituye en todos los casos a
la clonación clásica. En muchas...