Ldh A Ph 7

En la purificación de una proteína se deben tomar en cuenta diferentes consideraciones. La fuente de proteína seleccionada fue una pechuga de pollo, esta elección se basó en la facilidad de obtenciónde cantidades suficientes de LDH en dicho tejido. Para liberar el contenido intracelular de la pechuga se requirió un proceso de ruptura mecánica, en este caso se utilizó una licuadora de usodoméstico. Posteriormente se realizó una centrifugación diferencial, un proceso en el que el lisado celular se centrifuga a una velocidad que sólo elimina los componentes celulares más densos que la organelade interés; luego de ello se centrifuga a una velocidad que asegure la sedimentación de esa organela.2 Una vez obtenida la proteína se realizó el método de precipitación por salado con (NH4)4SO4, estocon el propósito de remover una cantidad importante de contaminantes. Después de la precipitación se retiró el agente precipitante mediante una columna empacada de Sefadex-G25®, la cual eliminamoléculas de peso molecular menores de 5000 Da, por lo que la proteína permanecerá retenida en la columna mientras que la sal y contaminantes de menor peso molecular serán eliminadas. Posteriormente, lamuestra se separó con un intercambiador catiónico. Esto debido a que el h del amortiguador de fosfatos utilizado tiene un pH de 7 y el punto isoeléctrico de la proteína es de 7.75, lo cual indica que elpunto isoeléctrico es mayor que el pH y la proteína tiene una carga neta positiva.
Una vez obtenida nuestra proteína pura, se cuantificó por medio del método colorimétrico de Branford, el cual sebasa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas.
Finalmente se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida enSDS. La carga negativa alta que imparte el SDS enmarcara la carga intrínseca de la proteína. El resultado neto es que las proteínas tratadas con SDS tienen formas y relaciones carga-masa similares....