Lisozima

Aislamiento y Purificación de Lisozima

Introducción
La lisozima, también conocida como muramidasa, fue descrita por primera vez por Alexander Fleming [1], forma parte de un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(14). Es un tipo de glicanohidrolasa que actúa sobre los enlaces que se dan entre los residuos N-acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG) queconstituyen las paredes bacterianas. Las lisozimas han sido encontradas en una gran variedad de especies [2]. Debido a esta gran distribución, es considerada un sistema primitivo e inespecífico de defensa, conocido como: “inmunidad innata”. Pueden encontrarse en numerosas secreciones como la saliva, las lágrimas y la mucosa nasal. Está presente también en los neutrófilos polimorfonucleares (célulassanguíneas), así como en grandes cantidades en la clara de huevo.  La deficiencia en lisozima, debida a mutaciones en el gen LYZ situado en el cromosoma 12, ha sido asociada a displasias esqueléticas y a un aumento de la propensión a las infecciones.
Fue la primera enzima secuenciada, de la que se dispuso un modelo tridimensional, cuando David Chilton Phillips consiguió una imagen porcristalografía de rayos X con una resolución de 2 angstrom [3][4].
Los distintos tipos de lisozima tienen una serie de características comunes: son proteínas globulares y básicas (pI= 10.5 – 11.0), presentan baja masa molecular (140 – 300 kDa), son estables a pH ácido y presentan actividad lítica frente a Micrococcus lysodeikticus.

La más estudiada es la de clara de huevo, está constituida por 129aminoácidos (14.6 kDa) con cuatro enlaces disulfuro. La molécula tiene forma helicoidal, compuesta por varias hélice-α y una lámina-β extendida formada por tres hojas β.
Objetivos:
Se ha tomado como objetivo proponer un método para el aislamiento y purificación de lisozima de huevo de gallina (Gallus gallus), aprovechando las características y propiedades de dicha enzima. Para ello, se ha realizado untratamiento ácido y posterior tratamiento térmico con el fin de conseguir desnaturalizar otras proteínas y conseguir su aislamiento.
A continuación, se han desarrollado dos cromatografías con fines comparativos. Una cromatografía de intercambio iónico empleando Amberlita G-50 y tampón fosfato potásico pH 6.6, en estas condiciones, la lisozima es la única proteína que se une a la Amberlita(exceptuando la avidina que tiene el mismo punto isoeléctrico). De forma paralela se ha desarrollado la cromatografía de penetrabilidad en Sephadex G-75, la lisozima, debido a su baja masa molecular, es separada de otras proteínas de mayor tamaño.
Una vez que la enzima ha sido purificada, se ha determinado la actividad y la cantidad de proteína presente en las distintas fracciones obtenidas, medianteensayos enzimáticos y electroforesis.

Materiales y métodos
Materiales: material biológico: huevo de gallina; ácido acético 0.1 M; tampón fosfato potásico 0.6 M, pH 6.6; tampón fosfato potásico 0.1 M, pH 6.6; tampón fosfato potásico 1 M pH 7; Sephadex G-75; Amberlita CG-50; Espectrofotómetros y colorímetros; Reactivo de Bradford (Biorad); BSA 1mg/ml; Paredes Mycrococcus lysodeikticus 0.3 mg/ml entampón fosfato 0.1 M, pH 6.6
Métodos:

1. Preparación del extracto enzimático: tratamiento ácido (E1).
Se separó la yema de la clara y se midió el volumen de ésta. La clara fue diluida con ¼ de ácido acético 0.1 M (3 volúmenes) agitando 5 min a temperatura ambiente. La dilución fue filtrada y se tomaron 16 ml de la misma, que se sometieron a centrifugación (5 min; 4500 rpm). Se midió elvolumen de sobrenadante (E1) y se guardó una alícuota de 1 ml en la nevera.
2. Tratamiento térmico (E2).
El sobrenadante E1 fue incubado en un baño de agua a 60ºC durante 5 min, enfriado posteriormente durante 5 min en un baño de hielo y centrifugado (5min; 4500 rpm). Se obtuvo un volumen de E2 de 12 ml y se guardó una alícuota de 1 ml en la nevera.
3. Cromatografía de penetrabilidad....