Localización y distribución subcelular de proteinas en plantas

Localización y distribución sub-celular de proteínas vegetales
Kevin Martínez. Ingeniería en Biotecnología Molecular, Faculta de Ciencias, Universidad de Chile. Curso de Fisiología Vegetal.

Los organismos vegetales han sido tema de estudio de tiempos inmemorables, desde su fisiología hasta su biología molecular, y las técnicas desarrolladas a lo largo del tiempo han facilitado esta tarea. Elestudio de las proteínas involucradas en procesos fisiológicos fundamentales para estos seres vivos ha conducido a lograr la localización y la distribución sub-celular de estas macromoléculas, como lo son las proteínas de membrana tilacoidal de cloroplastos PCI, PCII y las sub-unidades α y β de la ATP-sintasa, por medio de técnicas de biología molecular como el fraccionamiento sub-celular; o laidentificación y localización de proteínas de ciertos organelos por medio del uso proteínas fluorescentes como GFP, YFP, etc. Las cuales pueden ser fácilmente identificadas mediante microscopía de fluorescencia. Con estas metodologías fue posible identificar la presencia de las proteínas de membrana del tilacoide, obteniéndose así su peso molecular; mientras que con el uso de mutantes transitorios,fue posible lograr la identificación de la localización de proteínas de fusión a GFP, ubicadas en cloroplastos y RE.

Introducción

Los organismos vegetales contienen diversas proteínas distribuidas en toda la célula vegetal. Las proteínas de la ruta secretoria se sintetizan en ribosomas adheridos a las membranas del retículo endoplasmático, mientras que las proteínas del citosol,mitocondrias, cloroplastos y microcuerpos son sintetizadas por ribosomas citosólicos (Handford M., Distribución de proteínas y transporte vesicular, 4 de agosto 2014). En los cloroplastos, organelos que se encuentren en organismos fotosintéticos y cuya importancia es fundamental para la gran mayoría de los organismos del planeta, se encuentran las tilacoides, que son una membrana muy extensa en el queocurren las reacciones de la fotosíntesis, donde se cosecha luz para la posterior síntesis de ATP y NADPH. Estos sistemas cosechadores de luz son dos, y la clorofila se encuentra unida a ciertas proteínas en estos sistemas (Cardemil, L. Fotosíntesis, 11 de agosto de 2014). En plantas, se encuentra la proteína clorofila I y la proteína clorofila II (PCI y PCII), y además, se encuentra la ATP-sintasa,que está compuesta de varias subunidades, siendo las proteínas más abundantes en este complejo las subunidades α y β de Coupling Factor 1 (CF1). Con el objetivo de dilucidar la distribución de estas proteínas, se utilizan técnicas de biología molecular como el fraccionamiento sub-celular para obtener cloroplastos en un extracto crudo, y correr diferentes muestras tratadas aplicando electroforesisen gel SDS-PAGE.
Se puede lograr el estudio de otras proteínas vegetales por medio del uso de proteínas fluorescentes, que emiten fluorescencia bajo excitación por luz a cierta longitud de onda. Estas son la proteína fluorescente verde (GFP por sus siglas en inglés), que para hacer uso de estas, se requiere de la bacteria Agrobacterium tumefaciens para transformar genéticamente, en formatransitoria, un organismo vegetal para luego lograr su visualizar la fluorescencia en microscopía de fluorescencia.

Resultados
Distribución de proteínas en la membrana tilacoidal
Para visualizar la distribución de las proteínas clorofila I y II (PCI y PCII respectivamente), y las sub-unidades α y β de la ATP-sintasa, se estandarizaron las mediciones expresando los resultados utilizando cloroplastosen términos de la cantidad de clorofila (0,5 mg/mL) que existe en las muestras (NS, NP, TS, TP y C (extracto crudo de cloroplasto)). Posteriormente, luego de cargar el gel de electroforesis SDS-PAGE y dejar correr, fue posible observar los resultados. En la figura 1 se observan las bandas encerradas en cuadros correspondientes a las PCI y PCII en los carriles C, NP y TS, donde las bandas...