lolaso
Páginas: 20 (4945 palabras)
Publicado: 29 de mayo de 2013
Práctica 1:
Extracción de ADN total de Vitis vinifera
1.-Añadir 1 mL de tampón CTAB suplementado con 2% Antifoam B, adicionar una bola de disgregación (bola amarilla), arenilla de sílice y un trocito de hoja al tubo, con cuidado de no llenarlo completamente.
2.- Homogeneizar la muestra vorteándola durante un 1 minuto.
3.- Tomar 600 µL de la muestra homogeneizada y pasar a uneppendorf limpio.
4.- Incubar las muestras durante 30 minutos a 65 ºC.
5.- Añadir un volumen igual (600 µL) de Cloroformo:Alcohol Isoamilico (24:1). Mezclar bien con el Vortex.
6.- Centrifugar 10 minutos a 13000 rpm. Tomar 500 µL del sobrenadante y transferirlo a otro eppendorf limpio.
7.- Añadir 250 µL de NaCl 5 M (0,5 volúmenes) y 500 µL de Isopropanol. Mezclar bien.
8- Centrifugar10 minutos a 13000 r.p.m. Descartar sobrenadante y conservar el pellet
9.- Lavar pellet con 500 µL de Etanol al 70 %.
10.- Centrifugar 5 min a 13000 r.p.m. Descartar sobrenandante.
11.- Secar pellet en la bomba de vacío durante un par de horas, o bien un rato con un secador.
12.- Resuspender el ADN en 50 μl de agua estéril o TE.
Práctica 2:
Reacción en Cadena de laPolimerasa
Introducción
La PCR es una técnica de uso rutinario en los laboratorios de Genética Molecular, mediante la cual se obtienen millones de copias de un fragmento determinado de ADN (amplificación) a partir de una muestra de ADN denominado molde. Para realizar la PCR hacen falta los siguientes reactivos.
1- ADN molde: a partir del cual se quiere amplificar un fragmento osecuencia determinada. Normalmente es el ADN genómico.
2.- dNTP: son los nucleótidos necesarios para formar o producir las copias de ADN durante los diferentes ciclos de la PCR.
3.- Primers o cebadores: son moléculas de ADN de pequeño tamaño, que se van a unir por complementariedad a las secuencias flanqueantes de la región que se quiere amplificar. La ADN polimerasa utilizará estos primers unidosal ADN para realizar la polimerización o elongación de la región amplificada.
4.- Taq ADN polimerasa: es un enzima que añade nucleótidos (dNTP) a un ADN de cadena doble a partir de los extremos 3’. En concreto, va a añadir nucleótidos a los primers unidos a las regiones flanqueantes de la región que se quiere amplificar, usando para ellos las leyes de complementariedad A-T, G-C del ADN. La Taqes una polimerasa que soporta altas temperaturas, necesarias para los ciclos de desnaturalización del ADN durante la PCR.
5.- MgCl2: lo necesita la Taq para actuar, es un cofactor.
6.- Tampón de la Taq: en este tampón se encuentran todos los reactivos necesarios para que la Taq actúe eficientemente, y regula el pH de la reacción.
7.- Agua destilada y estéril: en ella se van a diluir todos estosreactivos que componen la mezcla de reacción.
Elaboración de la práctica
1.- Añadir 29 µL de agua en un eppendorf de 200µl.
2.- Añadir 5 µL de tampón de la Taq (10X).
3.- Añadir 3 µL de MgCl2.
4.- Añadir 3 µL de primer Forward.
5.- Añadir 3 µL de primer Reverse.
6.- Añadir 3 µL de dNTP.
7.- Añadir 2 µL de Taq polimerasa.
8.- Añadir 2 µL de ADN molde.
VOLUMEN FINAL 50 µL
-- Dejar en hielo hasta introducir el tubo en el termociclador.
-- Llevar a cabo el siguiente ciclo: 5’ a 94º C, 30 ciclos de 30’’ a 94º C, 30’’ a 59º C y 1’ a 72º C, finalmente realizar un ciclo de extensión final de 10’ a 72º C.
-- Cargar 5 µL del producto amplificado, una vez terminados los ciclos, en un gel de agarosa y realizar la electroforesis.
Práctica 3:
Digestión de ADN mediante el uso de Enzimas de Restricción
Introducción
La digestión de DNA se realiza con enzimas de restricción las cuales cortan secuencias de DNA específicas de 4 o más bases conocidas como dianas de restricción. Las secuencias que reconocen suelen ser secuencias palindrómicas, de manera que el corte da lugar a un par de extremos...
Extracción de ADN total de Vitis vinifera
1.-Añadir 1 mL de tampón CTAB suplementado con 2% Antifoam B, adicionar una bola de disgregación (bola amarilla), arenilla de sílice y un trocito de hoja al tubo, con cuidado de no llenarlo completamente.
2.- Homogeneizar la muestra vorteándola durante un 1 minuto.
3.- Tomar 600 µL de la muestra homogeneizada y pasar a uneppendorf limpio.
4.- Incubar las muestras durante 30 minutos a 65 ºC.
5.- Añadir un volumen igual (600 µL) de Cloroformo:Alcohol Isoamilico (24:1). Mezclar bien con el Vortex.
6.- Centrifugar 10 minutos a 13000 rpm. Tomar 500 µL del sobrenadante y transferirlo a otro eppendorf limpio.
7.- Añadir 250 µL de NaCl 5 M (0,5 volúmenes) y 500 µL de Isopropanol. Mezclar bien.
8- Centrifugar10 minutos a 13000 r.p.m. Descartar sobrenadante y conservar el pellet
9.- Lavar pellet con 500 µL de Etanol al 70 %.
10.- Centrifugar 5 min a 13000 r.p.m. Descartar sobrenandante.
11.- Secar pellet en la bomba de vacío durante un par de horas, o bien un rato con un secador.
12.- Resuspender el ADN en 50 μl de agua estéril o TE.
Práctica 2:
Reacción en Cadena de laPolimerasa
Introducción
La PCR es una técnica de uso rutinario en los laboratorios de Genética Molecular, mediante la cual se obtienen millones de copias de un fragmento determinado de ADN (amplificación) a partir de una muestra de ADN denominado molde. Para realizar la PCR hacen falta los siguientes reactivos.
1- ADN molde: a partir del cual se quiere amplificar un fragmento osecuencia determinada. Normalmente es el ADN genómico.
2.- dNTP: son los nucleótidos necesarios para formar o producir las copias de ADN durante los diferentes ciclos de la PCR.
3.- Primers o cebadores: son moléculas de ADN de pequeño tamaño, que se van a unir por complementariedad a las secuencias flanqueantes de la región que se quiere amplificar. La ADN polimerasa utilizará estos primers unidosal ADN para realizar la polimerización o elongación de la región amplificada.
4.- Taq ADN polimerasa: es un enzima que añade nucleótidos (dNTP) a un ADN de cadena doble a partir de los extremos 3’. En concreto, va a añadir nucleótidos a los primers unidos a las regiones flanqueantes de la región que se quiere amplificar, usando para ellos las leyes de complementariedad A-T, G-C del ADN. La Taqes una polimerasa que soporta altas temperaturas, necesarias para los ciclos de desnaturalización del ADN durante la PCR.
5.- MgCl2: lo necesita la Taq para actuar, es un cofactor.
6.- Tampón de la Taq: en este tampón se encuentran todos los reactivos necesarios para que la Taq actúe eficientemente, y regula el pH de la reacción.
7.- Agua destilada y estéril: en ella se van a diluir todos estosreactivos que componen la mezcla de reacción.
Elaboración de la práctica
1.- Añadir 29 µL de agua en un eppendorf de 200µl.
2.- Añadir 5 µL de tampón de la Taq (10X).
3.- Añadir 3 µL de MgCl2.
4.- Añadir 3 µL de primer Forward.
5.- Añadir 3 µL de primer Reverse.
6.- Añadir 3 µL de dNTP.
7.- Añadir 2 µL de Taq polimerasa.
8.- Añadir 2 µL de ADN molde.
VOLUMEN FINAL 50 µL
-- Dejar en hielo hasta introducir el tubo en el termociclador.
-- Llevar a cabo el siguiente ciclo: 5’ a 94º C, 30 ciclos de 30’’ a 94º C, 30’’ a 59º C y 1’ a 72º C, finalmente realizar un ciclo de extensión final de 10’ a 72º C.
-- Cargar 5 µL del producto amplificado, una vez terminados los ciclos, en un gel de agarosa y realizar la electroforesis.
Práctica 3:
Digestión de ADN mediante el uso de Enzimas de Restricción
Introducción
La digestión de DNA se realiza con enzimas de restricción las cuales cortan secuencias de DNA específicas de 4 o más bases conocidas como dianas de restricción. Las secuencias que reconocen suelen ser secuencias palindrómicas, de manera que el corte da lugar a un par de extremos...
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