Lowry y bradford

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

METODOS DE ANALISIS

“DETERMINACION DE PROTEINAS POR LOS METODOS DE LOWRY Y BRADFORD”

VAZQUEZ BECERRA ALBERTO

5QM1

FUNDAMENTOS:
La determinación de proteínas por el método de Lowry se basa en una reacción colorida transcurrida en 2 etapas. La primera consiste en la formación de un complejo colorido entre almenos 4 enlaces peptidicos de una proteína y cobre en medio alcalino (reacción de Biuret). La segunda es la reducción del acido fosfomolibdico-fosfotungstico por el complejo cobre proteína el cual da finalmente un color azul, de intensidad proporcional a la concentración de la proteína que se lee a 590 nm. El color producido depende del contenido de aminoácidos aromáticos (tirosina y triptófano)contenidos en la proteína.

El método de Bradford implica la reacción del azul brillante de Coomasie G-250 con las proteínas, originando un complejo colorido que se lee a 595 nm. A diferencia de la prueba de lowry esta no depende de la composición de aminoácidos de las proteínas. El color desarrollado es estable por una hora.

OBJETIVOS:
* Elaborar una curva de calibración para lacuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
* Determinar el efecto de algunas sustancias no proteicas, que pueden interferir en los métodos.
* Determinar si hay alguna diferencia significativa entre ambos métodos.
* Analizar las ventajas y desventajas que tienen ambos métodos con respecto a otros métodos y entre ellos para la determinación cuantitativa de proteínas.RESULTADOS:
Tabla 1. Curva de calibración de albumina por el método de lowry
Tubo | Cantidad de proteína (µg) | A590 | Serie ajustada por regresión lineal |
| | Serie a | Serie b | |
1 | 25 | 0.082 | 0.048 | 0.091 |
2 | 50 | 0.130 | 0.156 | 0.158 |
3 | 75 | 0.220 | 0.224 | 0.226 |
4 | 100 | 0.271 | 0.226 | 0.293 |
5 | 125 | 0.299 | 0.376 | 0.136 |
y=0.0027x+0.0234
Grafica 1.curva decalibración de albumina por el método de lowry

a) pendiente= 0.0027
Ordenada al origen= 0.0270
Coeficiente de correlación= 0.0992

b) la curva cumple con la ley de Bouger y Beer porque entre más cantidad de proteína había la absorbancia era mayor se cumple para toda la curva desde 25 a 125 µg de proteína.

c) factor de calibración de la curva F=1/0.0027=370.37

2.-análisis estadístico:
Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico
Tubo | A590 | Cantidad de proteína (µg) |
1 | 0.190 | 61.704 |
2 | 0.185 | 59.85 |
3 | 0.192 | 69.44 |
4 | 0.177 | 56.88 |
5 | 0.198 | 64.67 |
6 | 0.181 | 58.37 |
7 | 0.183 | 59.11 |
8 | 0.194 | 63.19 |
9 | 0.177 | 66.38 |
10 | 0.197 | 64.296 |

Media= 62.389
S= 3.93
S2= 15.44
CV= 6.299 %
Limites deconfianza de la media = 59.57<x<65.2

Tabla 3. Efecto de algunas sustancias no proteicas en el método de lowry
Tubo | Sustancia | A590 | Cantidad de proteína (µg) | Tipo de interferencia generada |
1 | Fenol al 1% | 2.203 | 807.26 | + |
2 | Mercaptoetanol al 0.1 % | 0.295 | 100.59 | + |
3 | Tris 1M, pH=10 | 0.263 | 88.74 | No hay |
4 | Urea al 5% | 0.213 | 70.22 | - |
5 | Sulfato deamonio al 3% | 0.240 | 80.22 | No hay |

Método de Bradford:
Tabla 4. Curva de calibración de albumina con el método de Bradford.
Tubo | Cantidad de proteína (µg) | A595 | Serie ajustada por regresión lineal |
| | Serie a | Serie b | |
1 | 25 | 0.223 | 0.271 | 0.219 |
2 | 50 | 0.361 | 0.244 | 0.341 |
3 | 75 | 0.481 | 0.478 | 0.464 |
4 | 100 | 0.589 | 0.625 | 0.586 |
5 | 125 |0.741 | 0.699 | 0.709 |
y= 0.0049x+0.096
Grafica 2. curva de calibración de albumina por el método de Bradford

a) pendiente= 0.0049
ordenada al origen= 0.196
coeficiente de correlación= 0.98

b) cumple con la ley de Bouger y Beer por que al ir aumentando la concentración de proteína también aumento la absorbancia, se cumple para toda la curva de 25 a 125 µg de proteína.

c)...