Lowry y Bradford

OBJETIVOS:
* Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
* Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud entro los métodos de Bradford y Lowry.
* Analizar las ventajas y desventajas del método del método de Lowry con respecto a Bradford.

INTRODUCCIÓN
El método de Lowry (1951)es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas que contengan tirosina y triptófano (aminoácidos aromáticos), según la ley de Lambert-Beer
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, seunen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.
El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de sucomplejo con tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin -Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugara un complejo de color azul intenso.

Está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarseen dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína.

RESULTADOS
1. Elaboración de la curva de calibración
Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina.
Método de Lowry.
Tubo No. | Cantidad de proteína (µg) | A590 | Serie ajustada por regresión lineal |
| | Seria A | Serie B | |
1 | 25 | 0.088 |0.003 | 0.0866 |
2 | 50 | 0.132 | 0.122 | 0.1216 |
3 | 75 | 0.170 | 0.177 | 0.1566 |
4 | 100 | 0.191 | 0.180 | 0.1916 |
5 | 125 | 0.217 | 0.223 | 0.2266 |


Figura 1. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Lowry. En este gráfico se muestran los puntos experimentales y la recta ajustada por regresión lineal, absorbancias leídas a 590 nm.
 
Tubo No. | Cantidad de proteína (µg) |A590 | Serie ajustada por regresión lineal |
| | Seria A | Serie B | |
1 | 25 | 0.127 | 0.15 | 0.1895 |
2 | 50 | 0.326 | 0.249 | 0.282 |
3 | 75 | 0.437 | 0.428 | 0.374 |
4 | 100 | 0.488 | 0.474 | 0.467 |
5 | 125 | 0.533 | 0.503 | 0.5595 |
Tabla 1. Curva de calibración de la Hemoglobina por el método de Bradford













Figura 2. Curva de calibraciónde Hemoglobina. Método de Bradford. En este gráfico se muestran los puntos experimentales y la recta ajustada por regresión lineal, absorbancias leídas a 595 nm.
a. Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen, y coeficiente de correlación; diga cómo se interpreta para la curva de calibración.
Método de Lowry | Método de Bradford |
m= 0.0014 | m= 0.0037 |
b=0.0516R2= 0.9483 | b= 0.097R2= 0.9026 |
Como se observa el coeficiente de correlación fue bajo para ambos métodos sabiendo que el valor establecido es = o > 0.99, resaltando que el segundo método tuvo mayor error que el primero, anteponiéndose el desempeño del analista.
b. ¿Cumple su curva la Ley de Bouger y Beer? ¿Entre qué límites de cantidad de proteína?
En la figura 1 y figura 2 se...