Lowry y Bradford

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
Prof. encargado: Francisco Fernández López
5QM2 Sección 2

PRÁCTICA 2: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY Y BRADFORD

OBJETIVOS
-Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de Hemoglobina empleando un método fotométrico.
-Determinar el efecto dealgunas sustancias no proteícas que pueden interferir en el método.
-Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud entre los métodos de Lowry y Bradford, tomando como método estándar Lowry.
-Determinar las ventajas y desventajas entre ambos métodos.

FUNDAMENTO

MÉTODO DE LOWRY:
Este método utiliza el Cu++ que forma complejos de coordinación con almenos dos enlaces peptídicos consecutivos en la proteína, reduciéndose a Cu+ y dando lugar a un compuesto colorido azul. El complejo Cu+-proteína, así como los grupos R de los aminoácidos aromáticos (tirosina, triptófano y cisteína) reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu y lo reducen produciendo un compuesto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno. Éste compuesto puedeser leído en un rango de 500-700 nm, la intensidad del color es proporcional a la cantidad de aminoácidos aromáticos en la proteína. El método de Lowry permite determinar la concentración de proteína en rangos de 0.01-1 mg/mL

MÉTODO DE BRADFORD:
Está basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomasie G-250 a diferentes concentraciones de proteínas. Esta unión del colorantecon las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del mismo desde 465 a 595 nm. El Azul Brillante de Coomasie G-250 se presenta en dos formas con colores diferentes, rojo y azul; siendo la azul cuando el colorante se une a la proteína.


RESULTADOS

CURVA TIPO

Tubo no.
Cantidad de proteína (μg)
A590 serie a
A590 serie b
1
25
0.023
0.017
2
50
0.073
0.082
3
750.115
0.120
4
100
0.161
0.140
5
125
0.209
0.213

m
a
r2

0.0018
-0.0206
0.96681
Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina.
Método de Lowry

Ecuación para calcular la Cantidad de proteína:
x = (y+0.0206)/0.0018






m
a
r2
0.0034
0.1703
0.99028

Tabla 2. Curva de calibración dehemoblogina.
Método de Bradford.

Ecuación para calcular la Cantidad de proteína:
x = (y-0.1703)/0.0034

ANÁLISIS ESTADÍSTICO



Tabla 3. Réplicas para análisis estadístico, Lowry. Tabla 4. Réplicas para análisis estadístico, Bradford.




Tabla 5. Resultados del análisis estadístico, Lowry.




Tabla 6. Resultados del análisis estadístico, Bradford.

EFECTO DESUSTANCIA NO PROTEÍNICAS
Tubo no.
Sustancia
A590
Cantidad de proteína (μg)
Tipo de interferencia
1
Tris pH 7
0.148
93.666
Negativa
2
Glicerol 1%
0.155
97.555
Negativa
3
Detergente 1%
0.145
92
Negativa
4
SDS 1%
0.203
124.22
Positiva
5
TCA 5%
0.162
101.444
------
6
Fenol 1%
1.648
927
Positiva
7
Mercaptoetanol 0.1%
0.166
103.66
------
8
Tris pH 10
0.082
57Negativa
9
Urea al 5%
0.137
87.555
Negativa
10
(NH4)2SO4 al 3 %
0.158
99.222
------
Tabla 7. Sustancias que pueden interferir en el método de Lowry.

Tubo no.
Sustancia
A595
Cantidad de proteína (μg)
Tipo de interferencia
1
Tris pH 7
0.450
82.264
-------
2
Glicerol 1%
.0437
78.441
-------
3
Detergente 1%
0.333
47.852
Negativa
4
SDS 1%
0.147
-------
Negativa
5TCA 5%
0.446
81.088
-------
6
Fenol 1%
0.519
102.558
Positiva
7
Mercaptoetanol 0.1%
0.478
90.5
Positiva
8
Tris pH 10
0.472
88.735
Positiva
9
Urea al 5%
0.427
75.5
-------
10
(NH4)2SO4 al 3 %
0.530
105.79
Positiva
Tabla 8. Sustancias que pueden interferir en el método de Bradford.


CÁLCULOS

1. Cálculo para la cantidad de proteína en cada tubo de la curva tipo....