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PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA GENERAL 2º CURSO LICENCIATURA DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA CURSO 2005/2006

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PRACTICA 1 PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO OBJETIVO : Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografía de intercambio catiónicoutilizando carboximetilcelulosa. Determinar la actividad de la lizosima en las diferentes fracciones de purificación.

INTRODUCCIÓN El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→ 4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana. Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la que se propuso unmecanismo de acción detallado. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las proteínas. Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrá carga positiva y a pH mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unirá a una resina con carga negativa (Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) yen el segundo a una resina con carga positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).

Una vez unida la proteína a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas: 1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI 2) mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na+ en el caso de intercambio catiónico o Cl- para el intercambio aniónico)

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Dado que el pIde la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las proteínas de la clara del huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas mediante la utilización de resinas intercambiadoras de cationes. La CM-celulosa es, debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a pHneutro y básico, una resina intercambiadora de cationes. A pH 10, la lisozima es prácticamente la única proteína que puede unirse a la CM-celulosa. Posteriormente, puede disociarse de la resina mediante lavados con un tampón de alta fuerza iónica. MATERIALES Y METODOS • Huevos de gallina para la obtención de la enzima. • Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10 • Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10,conteniendo 0.6 M NaCl • Carboximetil-Celulosa Activación de la CM: previamente a su utilización, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2 veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H2O (hasta pH neutro). Por último se hace una suspension 1/1 (vol/vol) en tampón glicina/NaOH 100 mM pH 10 • Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 6,2 • Suspensión de la bacteriaMicrococcus Lvsodeikticus 20 mg en 100 ml del tampón fosfato anterior A. PURIFICACION DE LA LISOZIMA 1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampón A. Tomar 10 ml de la muestra anterior en un tubo cónico con tapón de 15 ml. 2. Antes de comenzar la purificación de la lisozima separar una alícuota de 1 ml para medir la actividad de la enzima en la fracción de partida. 3.A los 9 ml restantes (Fracción O, Fo), añadir 4 ml de CM-celulosa previamente activada y agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina. 4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el sobrenadante (Fracción 1, F1). 5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de tampón A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Recoger el...