Método de extracción de RNA

PROTOCOLO EXTRACCIÓN RNA (MÉTODO CTAB).


1) Pesar 0.5 gr de tejido fresco o congelado con anterioridad en nitrógeno líquido.
2) Moler tejido con nitrógeno líquido.
3) Rápidamente añadir alhomogenizado 5 ml de Buffer CTAB. (el CTAB debe estar a 65 °C y antes de usar agregar 2% de -Mercaptoetanol). Mezclar directamente en el mortero y alicuotar 700 l en tubos eppendorf.
4) Incubar a65 °C durante 30 minutos.
5) Adicionar igual volumen de Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 (700 l) y centrifugar a 13.000 rpm por 10 minutos (25 °C)
6) Recuperar el sobrenadante. Adicionar 1/2 delvolumen recuperado con LiCl 10M (aprox. 350 l). Mezclar suavemente por inversión y precipitar durante toda la noche a 4 °C. (alternativamente precipitar RNA durante 4 horas a –80 °C o 6 horas a –20°C).
7) Centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos (25 °C), eliminar sobrenadante sin perder el pellet.
8) Disolver el pellet en 100 l de agua-DEPC (65 °C).
9) Agregar a cada muestra 1 l de DNasa I(1U/l) + 1 l Buffer 10X. (DNasa Invitrogen)
10) Incubar las muestras a temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente para detener la reacción agregar 1 l de EDTA 25 mM e incubar a 65 ºCdurante 10 minutos.
11) Finalizada la incubación transferir los tubos en hielo y adicionar igual volumen de Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 (100 l). Homogenizar suavemente por inversión.
12)Centrifugar a 13.000 rpm por 10 minutos. (25 °C). En esta etapa recuperar todos los sobrenadantes y transferirlos a un solo tubo eppendorf (aprox. 400 l)
13) Adicionar 1 ml de Etanol absoluto (-20 °C).Mezclar suavemente por inversión y precipitar a –80 °C durante 30 minutos.
14) Centrifugar a 13.000 rmp por 10 minutos (25 °C). Eliminar el sobrenadante y secar a temperatura ambiente.
15)Resuspender el pellet en 100 l de agua-DEPC (65 °C).
16) Agregar nuevamente a cada muestra 1.5 l de DNasa I (1U/l) + 1.5 l Buffer 10X. (DNasa Invitrogen). Incubar las muestras a temperatura ambiente...