Métodos colorimétricos para la Determinación de Proteínas

ÍNDICE





Métodos colorimétricos para la Determinación de Proteínas

Introducción
En esta práctica se utilizaran tres métodos para la cuantificación de proteínas: R. Biuret, R. Xantoproteinas y R. Adamkiewics.
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomolecular). Prácticamente todos los procesos biológicos dependende la presencia o la actividad de este tipo de moléculas (Berg et al, 2008).
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando de aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros propósitos.Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivador químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes (Segar, 2005).
OBJETIVO GENERAL

Aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteínaen una muestra problema.










A. REACCIÓN DE BIURET

Esta reacción debe dar una coloración purpura o violeta, cuando los enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos en un medio alcalino.
Material
Reactivos
3 tubos de Ensaye
NaOH al 10% (Hidróxido de Sodio)
2 pipetas graduadas
1 perilla
CuSO₄ al 1% (Sulfato de Cúprico)
Gradilla
Solución ProblemaProcedimiento:

1. Etiquetar los tubos de ensaye y las pipetas
2. Colocar 1ml de Solucion Problema en el Tubo de Ensaye
3. Colocar 1ml de NaOH al 10% y agitar
4. Añadir gota a gota solución de sulfato Cúprico, hasta tener un cambio de viraje en el color de la solución.

Marco Teórico

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuretcontiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.





La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada apartir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.
Espectrofotometría. Principios básicos
A diferencia de las pruebas realizadas anteriormente, la reacción de Biuret es cuantificable, es decir, a mayor concentración de proteínas, mayor intensidad decolor violeta. Esta reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.
Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medidade todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda (l) (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, quecorresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una l específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se...