Métodos Para Medir Actividades Enzimáticas

Los ensayos enzimáticos son métodos de laboratorio para medir actividades enzimáticas. Son vitales para el estudio de las cinéticas enzimáticas y la inhibición enzimática.

Unidades enzimáticas

Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de cualquier otro compuesto químico, o pueden ser cuantificadas en términos de actividad enzimática. La actividad enzimática es unamedida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción.
En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para laactividad catalítica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimática (UI).
• 1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 UI
• 1 UI = 1 μmol sustrato convertido x min-1 = 16,67 nkat
Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica. Ésta se refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de proteína, y se sueleexpresar en: μmol x min-1 x mg-1). La actividad específica da una idea de la pureza de la enzima.

Tipos de ensayo

Según la fase de la reacción estudiada

Todos los ensayos enzimáticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un tiempo. Existe un gran número de métodos diferentes para medir la concentración de sustratos y productos, y muchas enzimas puedenser ensayadas de diferentes maneras. Habitualmente en bioquímica se estudian las reacciones catalizadas por enzima usando cuatro tipos de experimentos:1
1. Medida de la velocidad inicial. Cuando una enzima se mezcla con un gran exceso de sustrato (a concentración saturante), el complejo intermedio enzima-sustrato se genera en una rápida fase inicial transitoria. Después, la reacción llega a unacinética constante durante la cual el complejo enzima-sustrato se mantiene prácticamente en cantidades invariables en el tiempo y la velocidad de reacción es constante. La velocidad se mide en un corto periodo después de lograr un estado cuasi-constante, que se detecta típicamente monitorizando la acumulación de producto durante el tiempo. Como las mediciones se efectúan en un periodo muy corto ypor la concentración saturante de sustrato, puede considerarse que el sustrato libre es igual al sustrato inicial y que la velocidad medida es la máxima que la enzima puede alcanzar en las condiciones de reacción dadas, porque no se están dando reacciones inversas o degradación enzimática. Estas mediciones son las más simples de realizar y analizar al estar relativamente libres de complicaciones,y por tanto éste el tipo de ensayo más usado en cinética enzimática.
2. Medida del progreso de la curva. En estos experimentos los parámetros cinéticos se determinan a partir de expresiones de las concentraciones de las diferentes especies como funciones del tiempo. La concentración del sustrato o del producto se mide en momentos posteriores a la rápida fase inicial y durante un tiempo losuficientemente largo que permita a la reacción acercarse al equilibrio. Este tipo de ensayos se intenta evitar por el error matemático que se puede introducir y es cada vez menos practicado, pero fue muy ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cinética enzimática.
3. Medida de la fase transitoria. En estos experimentos se observa el comportamiento de la reacción durantela rápida fase inicial transitoria en la que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cinético constante. Éstos son los ensayos más difíciles de realizar porque requieren el uso de técnicas de mezclado y medición realmente rápidas.
4. Experimentos en la fase de equilibrio. En estos experimentos se perturba una mezcla de enzima, sustrato y producto que ha alcanzado el equilibrio...