Manipulación de los Ácidos Nucleicos y Análisis de Proteínas

“Manipulación de los Ácidos Nucleicos y Análisis de Proteínas”


Biomedicina molecular

Índice










Tema Página

1.- Manipulación de los ácidos nucleicos………………………………………. 3
1.1.- Extracción y purificación.……………………………………………… 4
1.2.- Electroforesis en gel deagarosa…………………………………… 8
1.3.- PCR y RT-PCR……………………………………………………………….. 11
1.4.- Secuenciación……………………………………………………………… 16
1.5.- Enzimas de restricción y ligación………………………………….. 20
1.6.- Vectores de clonación………………………………………………….. 24
1.7.- Clonación molecular de un gen…………………………………….. 28
1.8.- Análisis bioinformático…………………………………………………. 32

2.- Análisis deproteínas………………………………………………………………… 33
2.1.- Vector de expresión……………………………………………………… 34
2.2.- Expresión de una proteína recombinante…………………….. 35
2.3.- Cuantificación colorimétrica de proteínas…………………….. 40
2.4.- Análisis electroforético en gel poliacrilamida……………….. 42
2.5.-Purificacion de proteínas……………………………………………….. 44
2.6 Ensayo Western Blot y ELISA…………………………………………… 62

3.- Bibliografía………………………………………………………………………………. 741.-Manipulación de los ácidos nucleicos

La manipulación de ácidos nucleicos ha permitido, entre otras cosas, el desarrollo de la clonación de secuencias de ADN para el estudio de mutaciones que estén involucradas en patologías, mapeo y secuenciación de genes con fines terapéuticos, desarrollo de la terapia génica, análisis forenses y de paternidad. La aplicación del ADN son múltiples, de manera que lastécnicas de laboratorio desarrolladas hasta la fecha para su estudio presentan una infinidad de variantes; por lo que estudiaremos:

-Extracción y purificación
-Electroforesis en gel de agarosa
-PCR y RT-PCR
-Secuenciación
-Enzimas de restricción y ligación
-Vectores de clonación
-Clonación molecular de un gen
-Análisis bioinformático











1.1 Extracción ypurificación

La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones. La calidad y la pureza de losácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados.
Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a loscriterios siguientes:
• Ácido nucleico diana
• Organismo fuente
• Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado)
• Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación
• Uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de
ADNc).

A continuación se recogen los principios de algunos de los métodos de extracción ypurificación de ácidos nucleicos que más se emplean en la actualidad.

Métodos de extracción
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte pararomper el material inicial complejo, pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
• Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica)
• Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles)
• Digestión enzimática (Proteinasa K)

Es posible romper...