Manual De Actividades

MANUAL DE ACTIVIDADES
PRÁCTICAS SECUENCIADAS
Estudio de la enzima Betaína Aldehído
Deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa

..una propuesta para el laboratorio del módulo
de Biomoléculas de la carrera de Biología.

Rocío Vargas Martínez & Roberto Velasco García
Laboratorio de Osmorregulación, FES Iztacala.
Proyecto PAPIME PE207811
1

Los autores dedicamos este manual a la memoria del
Dr. SergioGonzález Moreno: profesor ejemplar,
investigador perseverante y compañero generoso
que dejó huella en la carrera de Biología de nuestra
Facultad.

2

CONTENIDO


PROPÓSITO DE ESTE MANUAL

PÁGINA

3

 LA BETAÍNA ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE P.
aeruginosa, UNA PROTEÍNA MODELO PARA ESTUDIAR.

5

 ACTIVIDAD
in
silico.
UTILIZACIÓN
DE
LA
BIOINFORMÁTICA Y LAS BASES DE DATOS EN INTERNET
PARA EL ESTUDIODE LAS PROTEÍNAS.

10

 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL I. PURIFICACIÓN DE LA
ENZIMA BADH DE P. aeruginosa POR CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IÓNICO Y ENSAYO DE SU ACTIVIDAD.

28

 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL II. CUANTIFICACIÓN DE LA
BADH PURIFICADA Y EVALUACIÓN DEL RENDIMIENTO
DEL MÉTODO DE PURIFICACIÓN.

36

 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL III. DETERMINACIÓN DE LA
PUREZA Y DEL PESO MOLECULAR DE LA BADH
UTILIZANDOELECTROFORESIS
EN
GELES
DE
POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE).

48

 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL IV. ANÁLISIS CINÉTICO EN
ESTADO ESTACIONARIO DE LA BADH PURIFICADA.

58

 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL V. TRANSFORMACIÓN DE
Escherichia coli CON UN VECTOR RECOMBINANTE QUE
POSEE EL GEN badh DE P. aeruginosa.
 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL VI. AMPLIFICACIÓN DEL
GEN badh DE P. aeruginosa UTILIZANDO LA REACCIÓN EN
CADENADE LA POLIMERASA (PCR).

69

 ACTIVIDAD EXPERIMENTAL VII. SOBREEXPRESIÓN DE
LA BADH RECOMBINANTE.

85

 APÉNDICE. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

91

76

3

PROPÓSITO DE ESTE MANUAL
El desarrollo actual de la Biología, especialmente en las áreas de la genómica y la
proteómica, obliga a la actualización no sólo en las técnicas empleadas en el laboratorio,
sino también en la estrategia pedagógica paralograr una mejor integración del
conocimiento en los alumnos, al mismo tiempo que se capacitan en técnicas que deben
aprender para su futuro desempeño profesional. Este manual pretende guiar a los alumnos
que cursan el módulo de Biomoléculas en la realización de actividades secuenciales, en las
que el producto obtenido en una sesión experimental sea utilizado para su análisis en la
siguiente.Consideramos que este tipo de estrategia podría facilitar la comprensión de la
relación que existe entre la estructura y la función de las proteínas y los ácidos nucleicos, y
la manera en que estas biomoléculas interactúan intracelularmente. La molécula que hemos
seleccionado para ello es la proteína recombinante betaína aldehído deshidrogenasa
(BADH) de la bacteria Pseudomonas aeruginosa, una enzimaampliamente estudiada por
los autores de este manual, y cuyas características --facilidad de sobreexpresión y
purificación, elevada estabilidad estructural a temperatura ambiente y una relativa alta
capacidad catalítica— la hacen un excelente modelo para los fines didácticos mencionados.
Como primera actividad y previo a la ejecución de las sesiones experimentales, el
alumno deberá realizar unaactividad in silico, en la que utilizará diversas herramientas
bioinformáticas, bases de datos en internet y un visualizador molecular que le permitirá
obtener un mayor conocimiento sobre la estructura y las propiedades fisicoquímicas de la
proteína de interés y familiarizarse con ella. Posteriormente, el alumno realizará un total de
siete sesiones experimentales, en las que utilizará técnicas decromatografía en columna
para purificar la proteína mencionada, cuantificarla por diferentes métodos, determinar su
actividad enzimática y obtener sus parámetros cinéticos básicos. Utilizará también
herramientas de biología molecular para transformar células de E. coli con un vector que
posee el gen badh y obtener una cepa recombinante; además, el alumno amplificará el gen
de la BADH por PCR y...