Manual de Técnicas Especiales

MANUAL DE TÉCNICAS ESPECIALES.




INTRODUCCIÓN:
La Inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula.
La inmunofluorescencia, como todos los inmunoensayos, aprovecha la capacidad que tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a unadeterminada molécula blanco; pero se diferencia de otras técnicas inmunoquímicas en que aquí la marca unida al anticuerpo es una molécula fluorescente tal como por ejemplo, elisotiocianato de fluoresceína.
El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biológico y luego se expone la muestra asi tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada por medio deun monocromador. Esta luz de onda corta genera un fenómeno de fluorescencia en la molécula marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda más larga (verde, amarillo o naranja).
Esta luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por fotometría o en el caso de tratarse de preparados histológicos, puede ser observada por medio de un microscopio de fluorescencia. En el caso de la utilizaciónde la inmunofluorescencia como método de tinción para microscopía óptica, el fluorescente revela la localización a nivel celular o subcelular de la molécula diana.










TIPOS DE TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA:
Primaria o IFD 
La Inmunofluorescencia primaria, o directa, también conocida por sus siglas IFD (Inmunofluorescencia directa), hace uso de un único anticuerpo que seencuentra químicamente unido a un fluoróforo. El anticuerpo reconoce la molécula diana y se une a ella directamente. En el caso de utilizarse como técnica de tinción inmunohistoquímica la región donde se deposita la molécula diana puede ser identificada al microscopio de fluorescencia como una zona brillante.
Esta técnica presenta algunas ventajas con respecto a la IFI (indirecta). Reduce el número deetapas necesarias, por lo tanto es mas rápida y por otro lado es menos sensible a interferencias debidas a reactividad cruzada de los anticuerpos o a reacciones no específicas, las cuales tienden a aumentar el ruido de fondo de la técnica.
Secundaria o IFI 
La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se une a al moléculadiana, mientras que el secundario que es el que se encuentra marcado con el fluoróforo, reconoce al primario y se une a él. Esta técnica es un poco más compleja que la IFD, requiere más pasos y es más posible que sufra interferencias, pero en contrapartida es mucho mas flexible que una técnica directa y debido a que es posible que un anticuerpo primario una a mas de anticuerpo secundario, implicaun efecto de amplificación que también aumenta la sensibilidad de la técnica.
Esta técnica es posible, debido a que los anticuerpos constan de dos partes, una región variable (que es la que reconoce al antígeno) y una región constante (que forma el esqueleto y estructura básica de la molécula de anticuerpo). Es importante notar sin embargo, que esta división es artificial y que en realidad lamolécula de anticuerpo se encuentra formada por cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos livianas, estas últimas son las que contienen la región variable.
Es posible que existan varios anticuerpos que reconozcan diferentes antígenos (diferentes regiones variables) pero que compartan la misma región constante. Todos estos anticuerpos con diferentes especificidades pueden serreconocidos a su vez por un único anticuerpo secundario que reconozca la región constante. Esto ahorra el esfuerzo técnico y el costo de modificar cada uno de los anticuerpos primarios para acarrear el fluoróforo.
Típicamente se hace uso de diferentes anticuerpos primarios con diferentes regiones constantes generados por la estimulación en la producción de anticuerpos en diferentes especies. Por...