Manualito vph

MEZCLAS DE REACCIÓN Y CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN PARA VPH

|Mezcla de reacción para β-globina y MY09/11 |
|REACTIVO |Volumen |Concentración stock |Concentración final |
|Agua ultrapura |31.8 |--|Cbp 50μl |
|Buffer de PCR |5 |10x |1x |
|MgCl2 |3 |50mM |3mM |
|dNTP´s |1 |10mM |200μM ||(GH20 ó MY09) |1 |50pmol/ μl |50pmol |
|(PCO4 ó MY11) |1 |50pmol μl |50pmol |
|Taq polimerasa (Invitrogen) |0.2 |5u/μl |1U |
|ADN total|7 μl |-- |200ng |

• Para muestras de boca se corrieron con 5μl por extracción casera (Chang).
• Para otras muestras de cérvix con extracciones caseras se corrieron hasta con 10 μl, sobre todo para β-globina (telma canto).
• Para las muestras de embarazadas, se observó un exceso de ADN, siendo necesario eluso de diluciones (1:2, 1:5) llegando a utilizar de 3.5μl, 2.5 μl hasta 1μl de ADN.

|Mezcla de reacción para la detección de VPH |
|MY09/11 con go-taq |
|REACTIVO |Volumen |Concentraciónstock |Concentración final |
|Agua ultrapura |26.8 |-- |Cbp 50μl |
|Reaction Buffer de PCR |10 |5x |1x, 1.5Mm de MgCl |
|MgCl2 |3 |25mM |1.5mM|
|dNTP´s |1 |10mM |200μM |
|MY09 |1 |50pmol/ μl |50pmol |
|MY11 |1 |50pmol μl |50pmol |
|Go-Taq(Promega) |0.2 |5u/μl |1U |
|ADN total |7 μl |-- |200ng |

• Para muestras de embarazadas se observó mejores resultados con 5μl de la extracción por Kit de Qiagen.
• Para las muestras de embarazadas con excesode ADN, se corrió MY´S con la misma dilución a la cual dio positiva la reacción de β-globina.

|Condiciones de amplificación para β-globina y MY09/11 |
|PROCESO |TIEMPO |TEMPERATURA |No. CICLOS |
|Desnaturalización inicial |9 min |95ºC|1 |
|Desnaturalización |1 min |95ºC | |
| | | |38 |
|Alineamiento |1 min |55ºC | |...