Marcadores Moleculares

RESUMEN DE MARCADORES MOLECULARES DE ADN
DEFINICIÓN
Los marcadores moleculares han sido definidos como cualquier diferencia notípica controlada genéticamente.
Se puede considerar que cualquier molécula, orgánica o inorgánica, que sea característica de un organismo o proceso sea un marcador.
Los marcadores idóneos son los de ADN, siendo válido cualquier fragmento que se encuentre muy cercadel gen o de la secuencia de interés y que lógicamente no afecte al carácter en estudio (SIDTA 1999). Para aladez y Kahl (2000) un marcador se refiere a cualquier molécula de proteína, ARN o ADN de tamaño o peso molecular conocido que sirve para monitorear o calibrar la separación de las mismas utilizando electroforesis o cromatografía, y un marcador genético como cualquier gen cuya expresiónpermite un efecto fenotípico que puede ser detectado fácilmente (por ejemplo, un gen que ocasiona resistencia para algún antibiótico).

RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA (Amplificación al Azar de ADN Polimórfico)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) resulta en la amplificación de porciones específicas del ADN templado, mediada por el agregado de oligonucleótidos iniciadores. Esteproceso cíclico tiene tres pasos básicos:
* Desnaturalización térmica del ADN,
* Annealing de los iniciadores al ADN templado
* Extensión de los iniciadores por la enzima ADN polimerasa en presencia de 4 dNTPs y CI2Mg.
Los fragmentos de ADN son amplificados exponencialmente durante 25-45 ciclos, separados por electroforesis y visualizados por el teñido con bromuro de etidio. En uncomienzo la reacción de PCR se lograba con el agregado a la mezcla de reacción del fragmento termosensible Klenow (Escherichia coli), en cada nuevo ciclo.
Posteriormente, con el aislamiento de una enzima termoestable de la bacteria Thermus aquaticus se pudo automatizar la amplificación in vítro del ADN en equipos termocicladores. El desarrollo de esta tecnología permitió contar con un nuevo set demarcadores moleculares para comparar organismos a nivel de ADN.
Los marcadores moleculares RAPDs son obtenidos tras la amplificación por PCR de segmentos al azar del ADN, utilizando secuencias arbitrarias de oligonucleótidos iniciadores. Williams et al. (1990) fueron los primeros en utilizar este procedimiento en el mapeo del genoma en organismos vegetales, acuñando el nombre de RAPDs a losproductos obtenidos. Welsh y McClelland (1990) al mismo tiempo desarrollaron esta metodología para aplicaciones de fingerprinting denominándolos AP-PCR (arbitrarily primed PCR), finalmente Caetano-Anolles et al. (1991) los nombraron DAF (DNA amplification fingerprinting). Las diferencias en la denominación de estos marcadores dependen de las condiciones específicas de la reacción de amplificación o dela separación y detección de los productos amplificados. Los iniciadores arbitrarios usados en RAPDs son usualmente de 9-10 pares de bases, con un contenido de GC de 50-80% sin secuencias palindrómicas. El número de fragmentos de ADN amplificados es dependiente del iniciador y del ADN genómico empleados. Las condiciones de la reacción de PCR limitan el tamaño de los fragmentos obtenidos entre100-3000pb.
Las diferencias a nivel de ADN entre individuos pueden deberse a:
1- Cambios de nucleótidos que impiden la amplificación por la introducción de un mismatch en el sitio de unión del iniciador,
2- Deleción del sitio de unión del iniciador,
3- Inserciones que aumentan demasiado la distancia entre los sitios de unión de los iniciadores para permitir la amplificación y
4- Insercioneso deleciones que cambian el tamaño del fragmento amplificado.
Estos tipos de polimorfismo hacen que los marcadores RAPDs sean empleados para estudios de diversidad genética, construcción de mapas genéticos, mapeo de caracteres en poblaciones segregantes, líneas isotónicas y usando análisis segregante en bulks, ADN fingerprinting, saturación de marcadores en regiones determinadas del genoma,...