Materiales y métodos

MATERIALES Y MÉTODOS
Actividad de la H+-ATPasa
Para determinar la actividad de laH+-ATPasa se diluyeron 2.5 mL de la suspensión de levadura con 20 mL de agua destilada.
Esta suspensión demantuvo en constante movimiento con ayuda de una parrilla con agitador magnético, inmediatamente se midió el pH con el potenciómetro previamente calibrado. Posteriormente se repetio la medición depH dos veces más con intervalos de 3 minutos hasta obtener un valor basal.
Sin retirar el electrodo de la muestra, se añadieron 1.5 mL de glucosa al 10% y de inmediato se inició el conteo deltiempo. Se tomó lectura del pH a los 0, 1.5, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 36 minutos.

Transporte de glucosa
Para determinar el transporte de glucosa se retiraron 500 L de lasuspensión celular (2.5 mL de levadura más 20mL de agua destilada) a los minutos 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35 y se depositó cada alícuota en un tubo de microcentrífuga (1.5 mL) etiquetado.Se centrifugó de inmediato cada tubo a una velocidad de 14,000 rpm durante 2 min. Se recuperaron 100 L del sobrenadante en otro tubo de microcentrífuga y se mezclaron con 900 L de aguadestilada. De esas diluciones se utilizaron 100 L para cuantificar la glucosa.

Se enumeraron del 1 al 6 los tubos de la curva patrón. Se les agrego glucosa (100 g/mL): 0, 100,200,300,500, y 700µL mas agua destilada (1000 ,900,800,700,500 y 300lµL ). Para las muestras se enumeraron tubos del 7 al 14. Se les agrego a todos 900µL de agua destilada mas 100µL de . Al final se lesagregaron 1000µL de reactivo de cobre a los 14 tubos. Posteriormente se incubaron todos los tubos en baño maría durante 20 minutos.

Después se enfriaron los tubos y se les agrego a cada uno 1 mLdel reactivo de arsenomolibdato. Después se añadieron 7 mL de agua destilada a cada tubo y se midió la absorbancia a 590 nm, utilizando como blanco de reactivos el contenido del tubo número 1.