Matrimonio

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

FACULTAD DE CIENCIAS




“EFECTO DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA ADENOVIRAL E1B-55KDa, EN EL CICLO DE REPLICACIÓN DE ADENOVIRUS”.






Presenta. Azul Angélica Guzmán García





Tutor. Dr. Ramón A. González García-Conde
Cuernavaca Mor. Mayo 2011



índice


Resumen. 2Clasificación. 5
Estructura. 5
Genoma de adenovirus. 7
Ciclo de replicación. 8
Adsorción y entrada. 9
Unidades de transcripción tempranas (E1A, E1B, E2, E3 y E4). 11
E1A. 11
E1B. 11
E2. 12
E3. 12
E4. 12
Expresión de genes virales tardíos. 13




p53. 14

INTERACCIONES DE LA E1B-55kDa. 16

Antecedentes. 17

Modificaciones post-traduccionales de laproteína E1B-55kDa. 17

Justificación. 18


Hipótesis. 19


Objetivo General. 19

Objetivos Particulares. 19

Estrategia experimental. 20

Materiales y métodos. 21
Células y virus. 21
Amplificación de Hr6. 21
Preparación de células competentes. 22
Transformación de células competentes. 22
Midipreps. 23
Transfección. 23
Inmunofluorescencia. 24Inmunofluorescencia para ensayos de complementación en contexto de la infección viral. 25
Anticuerpos usados para el ensayo de inmunofluorescencia. 26
Western blot. 27
Titulación por focos fluorescentes. 27

Resultados preliminares. 28


Cronograma. 31


Bibliografía. 32








Resumen.



Los adenovirus (Ad) han sido estudiados por más de cincodécadas. El continuo interés en estos virus radica en su utilidad para estudiar procesos fundamentales del funcionamiento de las células eucariontes, por ejemplo: el “splicing” alternativo del mRNA, la replicación, la transcripción, la traducción, la oncogénesis, la regulación del ciclo y la proliferación celular. Sin embargo, no ha sido posible describir a nivel molecular los procesos regulados por lacompleja red de interacciones entre las proteínas virales y celulares; entre otras, las actividades asociadas a los oncogenes virales que codifican para las proteínas tempranas, E1B-55kDa (E1B) y E4orf6 (Orf6), que resultan en la replicación productiva del virus o en la transformación oncogénica de las células.

La E1B es una proteína de 496 residuos. Ésta es una fosfoproteína que contienetres sitios de fosforilación; dos de ellos con secuencias blanco para Caseína Cinasa II (CK2, Casein Kinase 2,), Ser490 y Ser491, y otro para Caseína Cinasa 1 (CK1), en la Thr495. Estas modificaciones en la E1B son necesarias para la inhibición de la transcripción dependiente de p53 y como consecuencia para la inhibición de la apoptosis y la actividad transformante asociada a la E1B. Sin embargo,no se conoce con detalle cual es la función de la fosforilación de la E1B durante el ciclo de replicación del virus.

La fosfoproteína celular p53 es un regulador del avance del ciclo celular que responde a señales de estrés en la célula (hipoxia, radiaciones, daño a DNA), y su gen se encuentra mutado en cerca del 60% de los cánceres humanos. La p53 es una proteína multifuncional que esregulada principalmente por dos mecanismos: i) modificaciones post-traduccionales que regulan su unión a DNA y su actividad como factor transcripcional de genes involucrados en la reparación de DNA, detención del ciclo celular, apoptosis e inhibición de la angiogénesis; ii) degradación inducida por la E3 ubiquitina ligasa HDM2. Aunque en algunos modelos, el daño a DNA por medio de fármacos,incrementa el nivel de transcripción de p53, el principal mecanismo de regulación de la actividad de p53 ocurre a nivel post-traduccional.


Recientemente, en nuestro laboratorio se observó que la localización intracelular de la p53 es alterada durante la infección por Ad. En ausencia de la E1B, la p53 se acumula en el núcleo de la célula infectada. En contraste, en presencia de la E1B, la p53...