Mecanica

Detección molecular de Dientamoeba fragilis en heces:
eliminación de los inhibidores de la DNA polimerasa
CLAUDIA IRENE MENGHI*, CLAUDIA LILIANA GATTA*,
R. MAKIYA* y OSCAR CESAR MÉNDEZ*
MOLECULAR DETECTION OF Dientamoeba fragilis IN FAECES: REMOVAL OF
DNA- POLYMERASE INHIBITORS
We report an assay for the DNA purification of Dientamoeba fragilis trophozoites by means of a
commerciallyavailable spin-columns technique from frozen non-formalin-fixed human stool specimens
containing high concentrations of DNA -polymerase inhibitors. This method was compared with a
phenol/chloroform technique; followed both of them by an amplification assay and an electrophoresis
of amplicons. A nested PCR assay was developed to allow the detection of D. fragilis DNA. The DNA
extraction from D.fragilis trophozoites using a fast spin-columns procedure, yielded high-quality
DNA, free of impurities and enzyme inhibitors; in contrast with the phenol/chloroform technique,
where inhibition was observed when the amplification products were analyzed by agarose-gel
electrophoresis. Besides, the addition of SAF (sodium acetate-acetic acid-formalin) to faecal specimens,
that affects the integrityof DNA and, consequently, hinders its further amplification, was confirmed.
Key words: Dientamoeba fragilis, PCR, inhibitors, DNA purification.
INTRODUCCIÓN
Dientamoeba fragilis, fue considerado
inicialmente una ameba debido a su desplazamiento
por medio de pseudópodos. Estudios posteriores
lo ubicaron taxonómicamente dentro de los
flagelados1-3. Su distribución es amplia, con tasas
deprevalencia de 1,4% a 19%4. Este parásito
presenta complicaciones para su identificación,
y la mayor dificultad radica en su breve
supervivencia en el medio ambiente, así como la
mala conservación de los trofozoitos en los
medios de cultivo por un tiempo prolongado5,6.
Por lo tanto, para su identificación, la materia
fecal debe ser examinada inmediatamente, o
conservada en un fijadoradecuado. Hasta la fecha
no se conocen las formas quísticas, que en cambio
están presentes en la mayoría de los protozoarios.
Muy poco se sabe sobre su modo de transmisión,
epidemiología y patogenicidad. Sin embargo, su
elevada asociación con infecciones por
Enterobius vermicularis, sugirió su transmisión
a través de los huevos de este nematode7-10. Dicha
asociación tiene importancia clínicaporque la
presencia de uno de los parásitos hace
imprescindible la búsqueda del otro, dado que el
tratamiento de E. vermicularis es diferente del
de D. fragilis, y ambos parásitos afectan a niños
que se reinfectan periódicamente con el gusano
alfiler. La identificación de D. fragilis por PCR
tiene importancia epidemiológica, porque permite
estudiar su transmisión en diversas situaciones
147sanitarias. En la actualidad diversos autores
consideran a D. fragilis como agente causal de
síntomas gastrointestinales9,11; pero, recientemente,
a partir de la década del 90, se comenzaron a
publicar trabajos acerca de la determinación
molecular de D. fragilis. Es de notar, que el
análisis de la secuencia del rRNA de tipo 16S,
establece que D. fragilis pertenece al grupo de
lastrichomonas2. En investigaciones sobre la
variación genética de este parásito se ha llegado
a la conclusión de que este microorganismo
representa como mínimo dos entidades genéticas
significativamente diferentes12. La identificación
de ciertas secuencias del parásito en materia
fecal no había sido resuelta previamente, dado
que los autores citados trabajaron en medios de
cultivo.
El objeto de esteestudio es valorar la
importancia de la eliminación de los diversos
inhibidores de la DNA polimerasa presentes en
las muestras fecales que dificultan el diagnóstico
molecular de D. fragilis.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestras de materia fecal frescas o fijadas en
SAF (solución de acetato de sodio - ácido acético
- formol)13, fueron recibidas en el Área de
Parasitología del Departamento de...