medica

Electroforesis de proteínas
y de ácidos nucleicos
Definición
La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.
Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a uncampo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con fines preparativos.
Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.Fuerza del campo eléctrico
=
Fuerza de fricción
q⋅E
=
f⋅v
q = carga (C)
E = intensidad del campo (V/m = N/C)
 
f = coeficiente de fricción (C·V·s / m2 = kg/s)
v = velocidad de la molécula (m/s)
El coeficiente de fricción mide la resistencia intrínseca debida a las características de cada molécula, esencialmente su forma y su tamaño. Así, por ejemplo, las moléculas grandes y asimétricasposeen un mayor coeficiente de fricción que las pequeñas y compactas.
La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electroforética, μ
vE=μ=qf=Zef
(Z = número entero; e = carga del electrón)
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molécula define su separación en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van separandoprogresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, está constituido por iones, que son atraídos y así recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de éstos en el campo. Todo ello hace que el tratamiento teórico cuantitativo de la electroforesis sea muy difícil y que esta técnica resulte poco útil para obtener información precisa sobre la estructura delas moléculas. Sin embargo, es enormemente útil como técnica analítica y preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
1. De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la disolución y se determina ópticamente la posición del frente de avance o frontera con el disolvente.
2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran através de un disolvente, utilizando además un medio que soporta a éste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los componentes de la muestra.
3. Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo del proceso (para más información, véanse las pp.250-2 de Freifelder, 1999).
Estudiaremos únicamente laelectroforesis zonal, de uso más extendido.
Finalmente, debe señalarse que, aunque es menos frecuente, también se puede aplicar la electroforesis para la separación de células.
Medios de soporte para realizar la electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunossoportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la cargade cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual debenavanzar las moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación.
Medios de baja fricción
Medios de elevada fricción
papel
acetato de celulosa
gel de almidón
gel de agarosa
gel de poliacrilamida
gel de agarosa+poliacrilamida
separación...