Medición de actividad enzimatica y parametros cineticos para alfa-amilasa

1. INTRODUCCIÓN

Las enzimas pertenecen a las macromoléculas llamadas proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la "energía de activación" propia de la reacción. Se entiende por "energía de activación" al valor de la energía que es necesario aplicar (en forma de calor, electricidad oradiación) para que dos moléculas determinadas colisionen y se produzca una reacción química entre ellas, alcanzando un estado de transición.
La cinética enzimática estudia las velocidades de reacciones químicas. Uno de los objetivos principales es comprender los mecanismos de reacción, esto es, la descripción detallada de las diversas etapas del proceso de una reacción. La termodinámica es la quepermite saber si determinado proceso se produce en forma espontanea, pero proporciona escasa información sobre la naturaleza, o incluso, la existencia de los pasos que lo componen. (Voet y Voet, 2006).
Las mediciones cinéticas de las reacciones catalizadas por enzimas son algunas de las técnicas más poderosas para dilucidar los mecanismos catalíticos de las enzimas. Es por esto, que para determinarcuantitativamente los aspectos cinéticos de la reacción se procede a realizar ensayos enzimáticos mediante los cuales se puede medir la velocidad de una reacción enzimática. Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen medir los cambios experimentados en la concentración de sustrato (que va decreciendo) o bien en la concentración de producto (que vaaumentando). Existen diversos métodos para realizar estas medidas como los colorimétricos, basados luego en absorbancia de luz. La espectrofotometría permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (Bibian y Rojas, 2004)
Experimentalmente, la medición de la velocidad de reacción es un buen indicador para la medida de la actividad enzimática, sin embargodebido a que la velocidad de reacción disminuye a través del tiempo, se considera teóricamente a la actividad como la velocidad inicial de reacción. A partir del valor de actividad enzimática, gráficamente se puede obtener los parámetros cinéticos como KM y Vmax al usar un método de linearización de Lineweaver-Burke (Mathews et al, 2002).
En el presente práctico se dará a conocer un procedimiento deestudio basado en método colorimétrico (DNS) para cuantificar mediante espectrofotometría el producto de la reacción enzimática de preparado de α-amilasa, y así medir la actividad enzimática gráficamente a través del tiempo, para posteriormente obtener los parámetros cinéticos de KM y Vmax, desde una gráfica de recíprocos de actividad vs. Concentración de sustrato.



2. OBJETIVOS

2.1Objetivo general:
Determinar empíricamente la actividad enzimática y parámetros cinéticos KM y Vmax de un preparado de α-amilasa que efectúa reacción de catálisis de solución de almidón, para cuatro diluciones diferentes de sustrato.

Objetivos específicos:
Aplicar el Método del DNS como indicador colorimétrico de la reacción en la determinación de azucares reductores del producto.
Determinarabsorbancia de las soluciones resultantes del Método del DNS en un espectrofotómetro a 540 nm.
Evaluar gráficamente, por medio de la pendiente, la actividad enzimática en 4 distintas diluciones de solución de almidón (sustrato) previo a la obtención de parámetros cinéticos.
Aplicar el método de linearización de Lineweaver-Burke para obtención de datos.
Efectuar curva patrón de glucosa comomedida referencia experimental.
Construir gráficos de recíprocos de actividad enzimática vs recíprocos de concentración de solución de almidón para el ensayo.










3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1 Cinética Enzimática:
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una...